通用浓度加和模型预测有机磷与三嗪农药对绿藻的联合毒性

葛会林,刘树深,苏冰霞(.中国热带农业科学院分析测试中心,海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室,海南 海口 570；2.同济大学环境科学与工程学院,长江水环境教育部重点实验室,上海 200092)

通用浓度加和模型预测有机磷与三嗪农药对绿藻的联合毒性

葛会林1,2,刘树深2*,苏冰霞1(1.中国热带农业科学院分析测试中心,海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室,海南 海口 571101；2.同济大学环境科学与工程学院,长江水环境教育部重点实验室,上海 200092)

基于微板藻毒性试验测定5个有机磷农药与4个三嗪类农药的单个及联合毒性.根据半数效应浓度(EC50),对斜生栅藻96h生长抑制的毒性大小顺序为:西草净>阿特拉津>扑灭通>苯嗪草酮>草甘膦>敌敌畏>磷胺>乙酰甲胺磷>甲胺磷.这表明直接干扰光合作用电子传输的三嗪除草剂的藻毒性明显大于有机磷农药.以通用浓度加和作为参考模型,三嗪类农药按 EC50和 EC10(10%效应浓度)浓度比的混合物对斜生栅藻呈现加和毒性.有机磷农药按 EC50和 EC10浓度比的混合物在低浓度呈现加和毒性,在高浓度呈现协同毒性.有机磷与三嗪类农药按EC50和EC10浓度比的混合物在低浓度为加和毒性,在高浓度为协同毒性.

斜生栅藻；微板毒性试验；有机磷农药；三嗪除草剂；通用浓度加和；协同作用

藻类是水体中的初级生产者,处于水生食物链的基础环节,它们可以制造氧气和有机物,对水体生产力和水体污染的自净作用具有重要意义,因此在评价废水与化学品对水环境的影响时,都把藻类生长抑制试验作为一项重要内容[1].三嗪除草剂是植物光合作用电子传递的特异抑制剂.有机磷杀虫剂通过对乙酰胆碱酯酶的抑制对昆虫产生毒性.一些农药如阿特拉津、马拉硫磷和草甘膦等还能导致内分泌干扰效应如雌激素效应[2].研究表明除草剂与杀虫剂混用能产生增毒作用.如酰胺类除草剂乙草胺或丁草胺与杀虫剂三唑磷联用对蚯蚓的致死毒性会产生增毒作用,阿特拉津能增加毒死蜱、甲基对硫磷和二嗪农对伸展摇蚊的毒性,阿特拉津与特丁津能增加毒死蜱对溪流摇蚊和乙酰胆碱酯酶的毒性[3-5].由于各种农药的大量使用,使得不同种类的农药总是以混合物的形式而不是单独存在于环境中,生物体有可能暴露于多种有机磷与三嗪农药的混合物[6],此时联合毒性呈现何种作用模式需要进一步研究.因此,本研究选择5个有机磷与4个三嗪农药组分,并以斜生栅藻作为指示生物,基于通用浓度加和(GCA)模型对其混合物毒性进行评估.

混合物毒性相互作用(加和、协同或拮抗)目前多是采用统计分析、模型参考或把两者结合起来进行评估.参考模型一般包括等效线图、毒性单位(TU)、相加指数(AI)、混合毒性指数(MTI)、相似性参数(λ)、浓度加和(CA)、独立作用(IA)[7]及GCA等.等效线图与TU一般认为是较早提出的基础模型,现在可看作CA的特殊形式.AI、MTI与λ是基于TU的扩展模型.等效线图只能进行图形化定性评估,TU、AI、MTI与λ可进行数值化的定性评估.而CA、IA与GCA可进行混合物毒性的定量预测与定性评估.CA模型[式(1)]一般用于作用机制相似的化合物的联合毒性预测;IA模型[式(2)]源于独立事件概率公式,一般用于作用机制相异的化合物的混合物毒性预测[8].根据公式(1),CA无法预测超过组分抑制效应最小值的混合物效应[9].根据式(2),当效应超出 0～1范围时,IA模型也将失去其概率含义而失效.CA与IA用于评估包括完全和部分激动剂的混合物效应[10]以及雌激素的混合物效应[11]时也存在类似的问题.GCA模型[式(3)]是CA的一种扩展形式,其主要优势在于可以预测处于 CA盲区的混合物效应.

式中:n是混合物的组分数;ECχ,i为物质i单独引起效应χ%时的浓度;pi是第i个组分在混合物中的浓度比例;E CCA为CA预测产生χ%效应的混χ,m ix合物浓度;Ei为物质i单独引起的效应;EmIAix为IA预测的混合物效应;EmGiCxA为GCA预测的混合物效应;c为污染物浓度;α为最大值参数;K为中值参数.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

SpectraMax M5型酶标仪(美国 Molecular Devices公司),SW-CJ-IF型净化工作室(苏州佳宝净化工程设备有限公司),150C恒温光照振荡培养箱(金坛市亿通电子有限公司),LS-B50L型立式压力蒸汽灭菌器(上海医用核子仪器厂),BT25S型五位电子天平(赛多利斯公司),PHS-25型数显酸度计(上海天达仪器有限公司).微板选用96孔平底透明聚苯乙烯板(Corning 9018).

敌敌畏(CAS号62-73-7,纯度99.5%)、草甘膦(CAS号 1071-83-6,纯度 99.0%)、磷胺(CAS号 13171-21-6,纯度 98.3%)、乙酰甲胺磷(CAS号 30560-19-1,纯度 98.8%)、甲胺磷(CAS号10265-92-6,纯度 99.5%)和苯嗪草酮(CAS号41394-05-2,纯度99.5%)购买自Chem Service.西草净(CAS号 1014-70-6,纯度 99.2%)、扑灭通(CAS号 1610-18-0,纯度 99.6%)和阿特拉津(CAS 号 1912-24-9,纯度 97.4%)购买自Riedel-deHaen.受试9种农药的分子结构见图1.

1.2 微板藻毒性试验

受试生物斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(编号 FACHB-416),培养采用水生 4号(HB-4)绿藻通用培养基[12],其配方为(NH4)2⋅SO40.2g、MgSO4⋅7H2O 0.08g、NaHCO30.3g、Ca(H2PO4)20.03g、KCl 0.025g、1% FeCl30.15mL、土壤浸出液1mL和蒸馏水1000mL.微板藻毒性测试参考文献[13]方法进行,微板弃用最外一圈,第2、6、7和11列共24孔加入100μL纯水作空白对照,第3～5列与8～10列共36孔加入100μL的12个浓度并3次平行的单个农药或其混合物,最后向所有孔加入100μL处于对数生长期的藻液.微板放入培养箱中,设置光照度约3000lx,温度 22ºC,暴露 4d,每天同一时间于682nm波长处测定光密度(OD),测读前振荡 5s.单个农药进行 4块微板测试,农药混合物进行 5块微板测试.

图1 受试农药的分子结构Fig.1 Molecular structure of the test pesticides

根据生物量法[1]计算污染物对藻的生长抑制毒性,由式(4)计算藻生长曲线在(t0,tj)时间范围内所围面积(A),根据空白组藻生长曲线所围面积(Ac)与暴露组藻生长曲线所围面积(At)按公式(5)计算藻生长抑制率(E).污染物对藻毒性的浓度-响应曲线(CRC)采用式(6)所示 Hill函数进行最小二乘拟合,其反函数[式(7)]用于计算与一定效应(χ%)对应的效应浓度(ECχ),拟合优度通过决定系数(R2)进行评价.

式中:tj表示第j时刻所经历的时间;ODj表示第j时刻藻液光密度.

1.3 混合物实验设计与毒性预测

根据单个农药效应浓度EC50和EC10,设计有机磷农药、三嗪类农药及两者混合分别按 EC50和 EC10浓度比的混合物(分别命名为 M1和M2,M3和M4,M5和M6).参考文献[10]将GCA模型拓展为式(8)所示的可用于多组分混合物的形式,基于单个组分的输入参数(ci,αi,Ki),使用GCA模型计算其混合物的效应.当混合物实测毒性大于或小于 GCA预测毒性时,判断混合物呈现协同或拮抗作用.

2 结果与讨论

2.1 单个农药毒性

微板毒性分析法测得5个有机磷与4个三嗪农药对斜生栅藻的浓度-响应曲线如图 2所示,采用Hill函数拟合得到相关参数及EC50与EC10见表1.以EC50作为标准,这9种农药对斜生栅藻的毒性从大到小为:西草净 > 阿特拉津 > 扑灭通 > 苯嗪草酮 > 草甘膦 > 敌敌畏 > 磷胺 >乙酰甲胺磷 > 甲胺磷.这个顺序与文献[13]结果基本一致.甲胺磷EC50是西草净的30万倍,通过直接干扰光合作用的三嗪除草剂的毒性明显大于有机磷农药的毒性,说明藻类对于除草剂比杀虫剂更为敏感,保护水环境中的初级生产者时要特别注意控制除草剂如三嗪类.

图2 单个农药对斜生栅藻生长抑制的浓度-响应曲线Fig.2 Concentration-response curves of single pesticides on the growth inhibition of Scenedesmus obliquus●:实测点; —:Hill拟合线

由表1与图2可见,敌敌畏、草甘膦与磷胺的最大值参数(α)大于1,最大抑制效应大于 1,通过分析可知是高浓度暴露组藻液OD减小之故,此时毒物浓度过高可能导致藻细胞死亡、分裂甚至溶解.乙酰甲胺磷、甲胺磷、苯嗪草酮、西草净、扑灭通与阿特拉津的α小于1,其效应增加到一定程度时趋于稳定,最大抑制效应小于 1,具体原因有待进一步研究.最大抑制率不能归一化到 100%,这是本研究采用Hill函数进行CRC拟合的原因.需要指出当α固定为1进行拟合时,中值参数(K)将正好为EC50.

表1 单个农药及其混合物对斜生栅藻生长抑制的Hill浓度-响应模型和关键毒性指标Table 1 Hill concentration-response models of single pesticides and their mixtures on the growth inhibition of Scenedesmus obliquus and key toxicity parameters

根据表 1,单个农药能引起的最大效应范围是从甲胺磷的0.52到磷胺的1.84,这导致CA模型能预测混合物的最大效应为0.52,大于0.52的效应范围为 CA预测盲区.由于部分组分(敌敌畏、草甘膦、磷胺)的最大抑制效应大于1,IA不适合预测本研究中的混合物效应.因此,采用GCA模型进行联合毒性预测,并作为联合毒性评估的参考模型.

2.2 农药联合毒性

由图3可见,对于有机磷农药混合物(M1和M2)的联合毒性,在效应小于50%的区域,GCA模型能对混合物CRC进行有效预测;而在效应大于50%的区域,混合物实测毒性高于GCA预测毒性,说明此时呈现协同毒性.王凌等[14]根据 AI指数也发现甲基对硫磷和毒死蜱对中肋骨条藻的联合毒性为协同作用.有机磷农药之间的协同毒性在其他指示生物体系研究中也有报道.贾玉玲等

[15]根据共毒系数(CTC)、TU、AI和MTI发现乙酰甲胺磷、三唑磷、氧乐果、敌敌畏和敌百虫的二元混合物对乙酰胆碱酯酶和发光菌的联合毒性为协同作用或部分相加作用.颜冬云等[16]根据CTC发现毒死蜱或甲胺磷与其他有机磷农药的二元混合物对乙酰胆碱酯酶的联合毒性主要为协同作用.Moser等[17]基于统计分析发现毒死蜱、二嗪农、乐果、乙酰甲胺磷和马拉硫磷能对大鼠产生协同的神经毒性.

GCA模型可以有效预测三嗪混合物(M3和M4)的联合毒性,三嗪除草剂对藻的联合毒性呈现加和作用.Faust等[8]也发现 18种对称三嗪除草剂对栅藻的联合毒性可被 CA模型准确预测,属于严格的相似作用物.王猛超等[18]将 CA模型拓展用于评估包含不同时间具有不同效应组分的嗪草酮、西草净和环嗪酮的混合物对青海弧菌的联合毒性,结果表明是加和作用,没有协同或拮抗作用.三嗪除草剂属于相似作用物,具有相同的毒性作用模式,即竞争性地置换光系统II反应中与D1多肽相结合的质体醌QB,从而导致电子传递受阻,所以对藻的联合毒性为加和作用.

对于有机磷与三嗪农药混合物(M5和M6)的联合毒性,在效应小于60%的区域,混合物CRC基本能被GCA预测;而在效应大于60%的区域,混合物实测毒性高于GCA预测毒性,说明此时有机磷与三嗪对藻的联合毒性呈现协同作用.张小敏[19]也观察到毒死蜱或马拉硫磷与阿特拉津对假微型海链藻的联合毒性为协同作用.这可能是由于三嗪抑制藻的光合作用而影响藻细胞的正常生长和代谢,使绿藻更容易受到有机磷的攻击;或者是有机磷破坏了藻的细胞膜结构,使三嗪更容易进入藻细胞所致.有机磷与三嗪的混合物对动物也能导致协同毒性.如Schuler等[20]通过对实测结果进行显著性分析,发现阿特拉津、西玛津和环嗪酮可以增强毒死蜱和二嗪农对伸展摇蚊的毒性,在更高浓度时增强程度更大.Lydy等[21]基于 TU方法发现阿特拉津和氰草津能增加毒死蜱对赤子爱胜蚓的毒性,分析可能是由于阿特拉津的存在改变了毒死蜱的吸收和生物转化.Pérez等[22]以IA作为参考模型,发现毒死蜱与阿特拉津或特丁津的二元混合物对生命早期阶段的斑马鱼毒性呈现协同作用.所以,在环境风险评估中对于有机磷与三嗪农药的复合污染应当给予重点关注.

图3 农药混合物对斜生栅藻生长抑制的浓度-响应曲线Fig.3 Concentration-response curves of pesticides mixtures on the growth inhibition of Scenedesmus obliquus●:实测点; -:Hill拟合线; ---:GCA预测线

3 结论

3.1 三嗪类农药对绿藻的毒性一般大于有机磷农药,本研究中甲胺磷EC50是西草净的30万倍,保护水环境中的初级生产者时要特别注意控制除草剂如三嗪类.

3.2 有机磷与三嗪类农药能导致协同毒性,在复合污染环境风险评估中应当给予关注.

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科学家发现北冰洋汞污染加剧

记者从中科院获悉,我国科考人员乘坐“雪龙”号在海洋边界层走航观测中发现夏季北冰洋大气汞循环的独特现象,经分析认为,夏季大气化学过程将导致北冰洋汞污染加剧.

中科院所属的中国科学技术大学极地环境研究室谢周清课题组一直依托我国极地破冰船“雪龙”号,建立船基海洋大气环境化学观测平台,开展多次海洋边界层走航观测,发现北冰洋大气汞呈现西高东低以及中心海冰区与开阔水域显著不同等空间分布特征.通过进一步研究,科研人员发现这种变化与海冰融化和淡水输入有关.

夏季随海冰融化,一年或多年老冰中的汞进入水体,在太阳光和微生物的作用下,溶于水中的汞被还原再次释放到大气中,导致冰区大气汞浓度高于开阔水域.另一方面,夏季环北冰洋特别是楚科奇海的河流携带高浓度的汞进入北冰洋,从而增加了海水中的溶解态汞.与此同时,河流带入高浓度的有机溶解物增加了溶解态汞还原为零价气态汞的能力,进而释放到大气中.

摘自中国环境网2014-08-21

Predicting joint toxicity of organophosphorus and triazine pesticides on green algae using the generalized concentration addition model

GE Hui-lin1,2, LIU Shu-shen2*, SU Bing-xia1(1.Hainan Provincial Key Laboratory of

Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables, Analysis and Testing Center, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China；2.Key Laboratory of Yangtze Aquatic Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China). China Environmental Science, 2014,34(9)：2413～2419

A microplate algae toxicity assay was performed to test the single and combined toxicities of five organophosphorus pesticides and four triazine herbicides. According to the median effect concentration (EC50), the toxicity effect on the 96h growth inhibition of Scenedesmus obliquus was in the following order: simetryn > atrazine > prometon > metamitron > glyphosate > dichlorvos > phosphamidon > acephate > methamidophos. This indicated that triazine herbicides inhibiting photosynthetic electron transport had greater toxicity than organophosphorus pesticides. The mixtures toxicities were evaluated by using generalized concentration addition (GCA) as the reference model. The mixtures of triazine herbicides in the ratios of EC50and EC10(10% effect concentration) presented additive toxicity on Scenedesmus obliquus. The mixtures of organophosphorus pesticides in the ratios of EC50and EC10presented additive toxicity in low concentration range and synergistic toxicity in high concentration range. The mixtures of organophosphorus and triazine pesticides in the ratios of EC50and EC10presented additive toxicity in low concentration range and synergistic toxicity in high concentration range.

Scenedesmus obliquus；microplate toxicity assay；organophosphorus pesticides；triazine herbicides；generalized concentration addition；synergism

X503.23

A

1000-6923(2014)09-2413-07

葛会林(1981-),男,山西晋城人,助理研究员,博士,主要从事复合污染毒理研究.发表论文10余篇.

2014-02-07

海南省自然科学基金(213027);国家自然科学基金(21177097)

* 责任作者, 教授,ssliuhl@263.net