抚顺盆地西露天组油页岩微生物碳代谢多样性分析

蒋绍妍,王文星,薛向欣*(.东北大学材料与冶金学院,辽宁 沈阳 089；.东北大学生命科学与健康学院,辽宁 沈阳 089)

抚顺盆地西露天组油页岩微生物碳代谢多样性分析

蒋绍妍1,王文星2,薛向欣1*(1.东北大学材料与冶金学院,辽宁 沈阳 110819；2.东北大学生命科学与健康学院,辽宁 沈阳 110819)

为探讨油页岩微生物的碳代谢功能多样性,以抚顺盆地西露天组油页岩为研究对象,利用Biolog-GN2和GP2微孔板检测法,在连续7d的培养期内,测定油页岩本源微生物群落水平生理图谱(CLPP),并根据化学基团的不同,分析微生物对不同类型碳源的代谢能力和代谢差异.结果显示,微生物对不同类型碳源的代谢程度和代谢速率存在明显的差异.革兰氏阴性和阳性细菌群落均对氨基类碳源的利用较好,其次是羧酸类以及糖和糖衍生物,而对磷酸糖利用较差.连续多点测算Shannon-Wiener,Simpson和McIntosh多样性指数,分析表明微生物群落碳代谢功能多样性总体较高,但是随着培养时间的增加,多样性略有降低.

油页岩；功能多样性；Biolog；碳代谢；多样性指数

油页岩是一种富含有机质、具有微细层理、可以燃烧的细粒沉积岩.我国已探明的油页岩总储量为 329.89亿 t,居世界第四位[1].微生物是重要的生物资源和基因资源[2].早在 1926年, Beckman[3]就提出了细菌采油的设想;1947年, Zobell[4]获得第一项微生物采油专利.微生物浸溶采矿的研究始于1947年,美国Colmer等[5]从矿山酸性矿水中分离鉴定出氧化亚铁硫杆菌并证实了其在浸出矿石中的生物化学作用;1959年,中国学者分别从不同矿山酸性矿水中分离得到了氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌等嗜酸细菌[6];迄今已经有20多个国家的学者展开了微生物在贫矿、废矿、表外矿及难采矿、难选矿、难冶矿的堆浸和就地浸出研究[7-11],浸出方式逐步也由池(槽)浸、地表堆浸扩展到了地下就地破碎浸出,并有向地下原地钻孔浸出发展的趋势.将微生物浸矿技术应用于油页岩的研究始于 1974年,Findley等[12]开展了利用氧化亚铁硫杆菌发酵液对美国绿河地区油页岩进行了连续浸矿研究,在14d的持续浸溶过程中,占油页岩总量约40%的矿物组分和几乎所有的 CaMg(CO3)2被去除.微生物转化技术在油页岩领域的研究目前仍属于起步阶段,相关报道不多[13-14],对油页岩本源微生物代谢多样性的研究是促进微生物转化技术在该领域发展的重要前提.

特定的生态环境决定相应的微生物群落结构,反之,微生物群落结构又会影响微生物生存的环境.沉积岩有许多特殊性质对微生物的生长代谢不利,而本源微生物的代谢功能在长期进化中逐渐与油页岩环境相适应,从而有能力代谢具有多种官能团、含有多种化学键的古代有机质.目前仅有关于微生物对黑页岩[15-17]、原油[18]和天然沥青[19]碳代谢的相关报道.本研究选择抚顺盆地西露天组油页岩作为研究对象,利用 Biolog-GN2、GP2微孔板技术分别测定油页岩中微生物群落水平的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌对不同化学基团碳源的利用能力及代谢差异,进而表征微生物的碳代谢功能多样性,力求反应 Biolog模板与细菌反应模式的相关性[20-21],这在油页岩相关研究中尚属首次.对油页岩微生物的群落功能进行了解和测定在现阶段研究中可能比对油页岩微生物的个体功能进行研究更加具有直接的意义,而 Biolog方法正是基于这种群落碳源代谢水平来进行多样性研究的.

1 材料与方法

1.1 供试样品

表1 样品的含水量、酸碱度、总DNA含量和活菌数量(平均值±标准偏差,n=3)Table 1 Water content, pH value, total DNA content and the number of living microbes (values are means ± S.D., n = 3)

油页岩于 2011年 6月采自抚顺西露天矿(123°57′E,41°50′N,海拔75.9m).矿区为温带大陆性季风气候,年平均气温 5～7 ,℃年平均降雨量 750～850mm.抚顺盆地为半咸水湖拗陷沉积形成,有机质来源以水生生物为主、陆源供给少,基底为下白垩统砂砾岩,油页岩赋存于古城子组、计军屯组和西露天组.古城子组主要由煤层组成,夹炭质页岩、油页岩及砂岩等;计军屯组主要由一套内陆湖相沉积的浅褐、暗褐色薄层状油页岩组成,含丰富的动植物化石,该岩段位于煤层顶部;西露天组油页岩由一套巨厚的绿色泥岩夹泥灰岩层组成,由于互层频繁,颜色为杂色及绿色.采样时去除表面沉积岩后,按五点法徒手(佩戴无菌手套)采集西露天组褐色油页岩细粒,并且避开聚集在局部的黑色页岩,锤子就地粉碎油页岩并充分混匀后过4mm筛子,四分法取适量放于50mL无菌离心管,与冰袋一起装入保温盒带回实验室4℃保存.所有工具均经高压蒸汽灭菌后烘干.3个重复取样地间隔约 500m.样品经东北大学分析测试中心测定灰分80.95%,挥发分16.57%,烧失量19.05%,水不溶物97.46%,含油率11.47%;X-Ray Diffraction分析主要为高岭石、菱铁矿和石英,X-Ray Fluorescence元素分析 SiO2为 43.90%,CO2为28.41%,Al2O3为 17.08%,Fe2O3为 5.36%,K2O为1.26%.样品含水量、酸碱度、微生物总 DNA含量和活菌数量列于表1.

1.2 微生物碳代谢多样性

使用Biolog Microplate(GN2、GP2)测算微生物群落的碳代谢功能多样性,经梯度实验确定稀释液浓度为 10-2,使用八道移液器向微孔板的每个微孔移入150μL稀释液,37℃避光培养7d,每隔12h使用酶标仪(BioTek μQuant)测定590nm吸光度.微生物种群整体活性采用微孔板每孔颜色平均变化率(AWCD)来描述,它可以评判微生物群落对碳源利用的总能力,AWCD=[∑(Ci-R)]/n,式中:Ci为第i孔吸光值;R为对照孔吸光值;n为微孔板孔数 95.采用生态学 3个 α多样性指数Shannon-Wiener、Simpson和McIntosh指数,从不同侧面反映微生物群落功能多样性, Shannon-Wiener指数H’=-∑Pi(lnPi),式中Pi为第i孔相对吸光值与整个微孔板相对吸光值总和的比率,即 Pi=(Ci-R)／∑(Ci-R);Simpson指数D=1-λ,式中 λ=∑Pi2;McIntosh指数 DM=(N-U)/ (N-N1/2),式中N=∑(Ci-R),U=[∑(Ci-R)2]1/2.

2 结果与分析

2.1 革兰氏阴性细菌利用 GN2微孔板碳源的动力学分析

图1 油页岩微生物利用Biolog GN2微孔板碳源的平均每孔颜色变化率(AWCD)曲线Fig.1 Average well color development (AWCD) for carbon sources of GN2 microplates Utilized by oil shale microbes

GN2微孔板的95种碳源按化学基团分为10类:糖和糖的衍生物28种,聚合物5种,甲酯2种,羧酸25种,酰胺类3种,氨基酸21种,核苷类3种,胺类2种,醇类3种,磷酸糖类3种.革兰氏阴性细菌对不同类型碳源的利用速率和程度不同(图1).甲酯类、羧酸类、核苷类、氨基酸以及酰胺类、胺类碳源均有明显的快速被利用阶段,分别在24～48,12～48,24～48,12～48,24～72,24～72,前四者被快速利用时间较短,均在培养48h前;后两者被快速利用时间较长,均在72h前.除这6类碳源外,其他碳源没有明显被快速利用阶段:糖和糖的衍生物在培养的180h内始终被较快利用;而聚合物类在72～96h时出现了停滞阶段,这可能与微生物群落结构和功能发生了一定改变、使微生物对碳源的代谢产生选择性变异或转移有关;磷酸糖类在108h前被快速利用,醇类则是在168h前.培养24h前,胺类被较好利用,24～120h期间氨基酸被较好利用,120h后,糖和糖的衍生物被较好利用;然而,磷酸糖类 AWCD却始终较低,说明样品中微生物对带有不同化学基团的糖类的利用存在差异.此外,微生物对醇类和聚合物的利用程度也较低.

2.2 革兰氏阳性细菌利用GP2微孔板碳源的动力学分析

GP2微孔板的95种碳源分为10类:糖和糖的衍生物44种,聚合物8种,甲酯1种,羧酸16种,酰胺类2种,氨基酸9种,核苷类8种,胺类1种,醇类2种,磷酸糖类4种.聚合物、羧酸类、醇类、酰胺类、氨基酸、胺类和核苷类碳源均有明显的快速被利用阶段,分别在24 ～ 60h,12 ～96h,12 ～ 60h,24 ～ 72h,12 ～ 60h,24 ～ 60h和24 ～96h;糖和糖的衍生物在 24h后始终被较快速利用,磷酸糖类和甲酯类碳源没有明显被快速利用阶段;羧酸类和核苷类在96h后、醇类和氨基酸在60h后,它们的AWCD增长较慢,胺类则在60h后基本停滞;聚合物类在60h后被利用速度逐渐变缓,96h后基本停滞;酰胺类在72 ～ 120h期间停滞,72h后又小幅上升(图2).培养12h后,氨基酸、酰胺类和胺类被利用程度明显高于其他碳源,且氨基酸 > 酰胺类 > 胺类;其次为羧酸类及糖和糖的衍生物,在24 ～ 132h期间,羧酸类大于糖和糖的衍生物,而132h后,后者被利用程度略大;核苷酸、醇类和聚合物被利用程度较低,72h前,聚合物 > 醇类 > 核苷类,而96h后,核苷类被利用程度最高,120h后,醇类被利用程度超过聚合物.对于磷酸糖类和甲酯类,在 108h前,二者被利用程度较低,在132h后,二者超过核苷类、醇类和聚合物.

革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌群落均对氨基酸、酰胺类和胺类碳源利用较好.氨基酸、酰胺类和胺都是氨基化合物,是氨分子中去掉一个氢原子的有机物,某种程度上具有类似的化学性质.微生物群落对羧酸类以及糖和糖的衍生物同样能够较好的利用,且对糖和糖的衍生物的利用从 24h后几乎保持着同一斜率上升,其滞后期较短,且在连续培养期内没有出现利用速率减慢的趋势,说明微生物对糖类的利用是持续升高的,与对磷酸糖的利用结果对比来看,微生物对不同种类糖的利用存在差异.

2.3 微生物碳代谢多样性分析

表2 在不同时间下微生物碳源代谢的多样性指数Table 2 Diversity indexes of microbial metabolism for carbon sources under different time

从表2可以看出,GN2和GP2微孔板的DM指数值在培养期前 36h逐渐降低,36h后基本不变;H’和D指数值则在整个培养期内变化很小.DM指数略有降低的原因可能是随着培养时间的增加,微生物代谢碳源的种类略有减少,氨基化合物和糖类代谢菌可能逐渐成为群落的优势菌.而从整个培养期内各多样性指数的数值来看,微生物碳代谢功能多样性在培养期间内虽存在显著变化但变化幅度较小,多样性总体较好,这意味着这些土著菌利用碳源的途径较多,但细菌、真菌和放线菌数量及微生物总DNA含量却较少(表1),这可能与油页岩本身性质有关,油页岩中水分低、养分低、杂质多,无机矿物质含量高于有机质含量,且有机质主要由复杂三维网状结构的干酪根构成,这些均不利于微生物的生长繁殖,导致该生境的微生物数量极低.在养分贫瘠的生态环境中,微生物的数量少但代谢多样性并不一定低,这一发现与曹成有等[22]对流动沙丘的研究结果一致,养分的贫瘠主要限制微生物的生长和繁殖,对有限资源的竞争,有可能会使少数微生物成为优势种.

3 结语

通过对油页岩本源微生物碳代谢多样性的深入了解,为后续开展微生物的分离培养提供一定的理论依据,也为进一步挖掘本源微生物在浸溶转化油页岩方面的利用潜力提供一条新的研究思路.在群落水平,革兰氏阴性细菌对氨基酸、胺类和酰胺类利用较好,对糖和糖的衍生物、甲酯类和羧酸类其次,对醇类、聚合物类和磷酸糖类较差;甲酯类、羧酸类、核苷类、氨基酸在12 ～48h、酰胺类和胺类在24～72h被利用效率较高.革兰氏阳性细菌对氨基酸、酰胺类和胺类利用较好,对羧酸类及糖和糖的衍生物其次,108h前,对磷酸糖类和甲酯类利用较差,而 132h后,对核苷类、醇类和聚合物类利用较差;聚合物、醇类、氨基酸和胺类在24～60h、羧酸类和核苷类在24～96h、酰胺类在 24～72h、糖和糖的衍生物在24～48h被利用效率最高.连续多点监测计算多样性指数H’、D和DM,其数值显示微生物群落碳代谢功能多样性总体较好;其动态变化特征说明随着培养时间的增加,微生物群落碳代谢功能多样性略有降低.由于微生物群落产生对某些碳源利用的较强烈偏好,因此在实际培养和生产过程中,需要通过外部添加营养源来促进油页岩中本源微生物的生长代谢时,应根据需要,合理搭配供给的碳源种类,特别是氨基化合物和糖类应作为基本成分,并综合考虑微生物对各碳源的代谢需要和代谢效率来确定较为经济高效的培养基和培养时间.

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Carbon-source metabolic diversity of oil shale microorganisms in Fushun Basin Western Open Group

JIANG Shao-yan1, WANG Wen-xing2, XUE Xiang-xin1*(1.School of Materials and Metallurgy, Northeastern University, Shenyang 110819, China；2.College of Life and Health Sciences, Northeastern University, Shenyang 110819, China). China Environmental Science, 2014,34(9)：2321～2327

Functional diversity of carbon-source metabolism of oil shale microorganisms in Fushun Basin Western Open Group was investigated by Biolog-GN2 and GP2 microplates method. The microbial community level physiological profiles (CLPP) were determined during 7 consecutive days. According to different chemical groups, the metabolic capacity and differences of microbial communities on different carbon sources were analyzed. The results showed that the metabolic level and metabolic rate of microbial communities on different carbon sources were obviously different. For the Gram-negative or Gram-positive bacteria communities, the utilization of carbon sources with amino group was the highest, followed by carboxylic acid, sugar and its derivatives, and sugar phosphates was the lowest. The analyses of Shannon-Wiener, Simpson and McIntosh indexes through multi-point calculation indicated that the carbon metabolic diversity of microbial communities in oil shale was generally high, but the diversity slightly decreased with incubation time.

oil shale；functional diversity；Biolog；carbon metabolism；diversity index

X172

A

1000-6923-(2014)09-2321-07

蒋绍妍(1985-),女,辽宁沈阳人,东北大学材料与冶金学院博士研究生,主要从事油页岩微生物多样性及油页岩微生物转化研究.发表论文6篇.

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2013-11-23

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