麝香保心丸抗心肌细胞缺氧-复氧损伤活性成分筛选

韩 琳，吕 超，李 敏，黄慧梅，畅婉琳，彭成成，柳润辉 (.第二军医大学药学院，上海 004；.福建中医药大学药学院，福建 福州 5008；.上海交通大学药学院，上海 0040)

麝香保心丸是在宋代著名方书《太平惠民和剂局方》收载的苏合香丸的基础上创新开发研制成功的现代中药，具有芳香温通、益气通心之功效，主要用于治疗心肌缺血引起的心绞痛、胸闷及心肌梗死，是目前国内临床上广泛应用于治疗冠心病的特效复方药物[1]。麝香保心丸由人参提取物、麝香、蟾酥、苏合香酯、冰片、牛黄和肉桂等7味药材组成[2]。现代药理学研究表明麝香保心丸具有抑制血清Tc及LDL-C的浓度升高，保护血管内皮细胞和基底膜完整，抑制血管壁炎症和内膜增生，抑制动脉粥样硬化的发展，同时能改善心肌代谢，增强心肌能量储备，促进DNA、RNA的合成，提高机体耐缺氧能力，增强心肌收缩力，提高血浆环腺苷酸(cAMP)水平，抑制血小板的聚集、稳定心肌细胞膜等药理作用[3]。

Xiang等[4]采用代谢组学方法研究了麝香保心丸对大鼠急性心肌梗死的整体药效及作用机制，表明麝香保心丸对大鼠急性心肌梗死有治疗作用，且主要通过改善心肌梗死引起的能量代谢异常、氧化损伤和炎症等途径对心肌梗死大鼠起到治疗作用。本课题组采用血清药物化学理论与HPLC-ESI-MS/MS和GC-MS方法相结合，分析了麝香保心丸的血中活性成分变化，共鉴定了20种血中活性成分[5,6]。本实验采用原代心肌细胞缺氧-复氧模型，在细胞水平上对麝香保心丸及其20种血中活性成分进行抗缺氧-复氧损伤的活性筛选，进一步明确其保护心肌的药效物质。

1 材料

1.1 仪器 二氧化碳培养箱(MCD-18M，日本)；恒温混匀仪(Eppendorf，德国)；台式高速离心机(Eppendorf，Centrifuge 5810，德国)；十万分之一电子天平(Sartorious，BP 211D，德国)；氮气罐(上海天翼气体有限公司)；酶标仪(BioTek，ELx800，美国)。

1.2 动物 新生1～3 d的SPF级Sprague Dawley(SD)乳鼠[上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2007-0005]。

1.3 试药 麝香保心丸(上海和黄药业有限公司，批号：120716)。肉桂酸、肉桂醛、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸和胆酸7种对照品均购自中国药品生物制品检定所。人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1和麝香酮8种对照品均购自上海鼎瑞化工生物科技有限公司。冰片、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基和日蟾毒他灵5种对照品均购自江西南昌贝塔生物科技有限公司。

1.4 试剂 高糖DMEM培养基、低糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、胰蛋白酶(GIBCO, 美国)；双抗(博光生物医药技术有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)、MTT试剂(Sigma，美国)。

2 方法与结果

2.1 原代心肌细胞的培养 本实验参考了Grynberg等[7]的细胞培养方案：用75%乙醇给乳鼠消毒后放进超净台，用剪刀在乳鼠胸腔下方2根肋骨之间剪开，轻轻挤压心脏自动蹦出，再剪取心尖并用4℃ 预冷的PBS将心尖上的残血洗净并将心尖均匀剪碎。加入0.08%的胰蛋白酶置于混匀仪中以37℃、450 r/min震荡消化心脏组织7 min。第1次消化的上清液弃去，从第2次开始到心脏组织消化完全后，将每次收集到的上清液加入到含有20% FBS的高糖DMEM培养基中以终止消化。最终收集总的上清液在离心机中以1 500 r/min离心10 min，并收集心肌细胞将其转移到培养皿中，然后放于二氧化碳培养箱中差速贴壁90 min后再将细胞悬液取出，混匀后计数。在第2～4天换液时在培养基中加入0.1 mmol/L的5-溴尿嘧啶以抑制成纤维细胞的生长，通过倒置显微镜观察细胞形态(图1)。

2.2 缺氧-复氧模型的建立 取长势良好的心肌细胞用于实验，以106个/ml的密度接种到96孔板中，每孔100 μl，在37℃、5% CO2培养箱中培养48 h后换液，换液后72 h用于实验。建立缺氧-复氧模型时模型组的培养液换成不含FBS的低糖培养基，并将二氧化碳培养箱的环境改成95% N2和5% CO2。在此环境下缺氧数小时后，再将培养液换回含20% FBS的高糖培养基，并回到正常条件(即95% 空气和5% CO2，37℃)下的二氧化碳培养箱中复氧数小时。参考文献资料，对缺氧-复氧的时间进行了摸索，分别是缺氧3 h复氧2 h(H3/R2)[8]，缺氧5.5 h复氧12 h(H5.5/R12)[9]以及缺氧4 h复氧12 h(H4/R12)。缺氧-复氧结束后，每孔加5 mg/ml MTT 溶液10 μl，然后在碳培养箱中培养4 h后终止培养，再将含有MTT的培养基弃去，每孔加入DMSO 150 μl，避光振摇10 min，使结晶充分溶解后用酶标仪测570 nm下每孔的消光度值(OD值)。数据用SPSS 16.0统计软件进行独立样本t检验。细胞存活率(%)=造模组OD平均值/正常组OD平均值×100%。所得结果如表1所示，最终选择H4/R12作为造模条件。

图1 培养5 d后10×20显微镜视野里观察到的心肌原代细胞

表1 H3/R2、H5.5/R12和H4/R12造模对比(n=48)

2.3 麝香保心丸对缺氧-复氧心肌细胞的保护作用 将麝香保心丸研磨成细粉状，精密称取4 g，用甲醇32 ml 加二氯甲烷16 ml 再加去离子水4 ml配成的混合溶剂超声提取30 min，抽滤提取液并收集滤液，在55 ℃下旋转蒸发制得麝香保心丸浸膏并于4℃密封保存。临用前精密称取2 mg，用DMSO 20 μl助溶，然后加入培养基配制成500 μg/ml的母液。将母液分别稀释成30、50、100 150 μg/ml的工作液。造模前1 h给药，各组之间平行操作。给药组和模型组缺氧4 h复氧12 h，造模结束后，每孔加5 mg/ml MTT 溶液10 μl，在二氧化碳培养箱中培养4 h后终止培养，然后将含有MTT的培养基弃去，并在每孔中加入DMSO 150 μl，避光振摇10 min，使结晶充分溶解后用酶标仪测570 nm下每孔的OD值。并用SPSS 16.0软件对数据进行单因素方差分析，结果如图2所示，30、50、100、150 μg/ml均为麝香保心丸的有效剂量，其中在50 μg/ml的剂量下具有较好的抗心肌细胞缺氧-复氧损伤作用。

图2 不同浓度的麝香保心丸对缺氧复氧心肌细胞存活率的影响

2.4 麝香保心丸中入血成分抗心肌细胞缺氧-复氧损伤的活性筛选 将20个入血成分精密称取一定量，并将每个成分配成250 μmol/L的母液，分别稀释成1、10、50 μmol/L的工作液。造模前1 h给药，各组之间平行操作。给药组和模型组缺氧4 h复氧12 h，空白组在正常条件下培养。造模结束后每孔加5 mg/ml MTT 溶液10 μl，在碳培养箱中培养4 h后终止培养，然后将含有MTT的培养基弃去，每孔加入DMSO 150 μl，避光振摇10 min，使结晶充分溶解后用酶标仪测570 nm下每孔的OD值。数据采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析，结果如图3所示。20种人血活性成分中有4种成分具有显著的保护心肌细胞缺氧-复氧损伤的作用，其中人参皂苷Rb1 在10 、50 μmol/L时具有显著的保护作用；人参皂苷Rb2 在50 μmol/L时显示有较强的保护作用；蟾毒灵和麝香酮在3个浓度下都具有保护心肌细胞缺氧-复氧损伤的作用，且在10、50 μmol/L时效果最佳。

3 讨论

本研究采用原代心肌细胞建立缺氧-复氧模型，并对麝香保心丸及其20种人血中活性成分进行抗心肌细胞缺氧-复氧损伤保护作用的筛选。研究结果表明，麝香保心丸在50 μg/ml的剂量下具有较好的抗心肌细胞缺氧-复氧损伤的作用；20种人血中活性成分中人参皂苷Rb1、Rb2、蟾毒灵和麝香酮具有明显的保护心肌细胞缺氧-复氧损伤作用，提示这4种成分是麝香保心丸中保护心肌细胞缺氧-复氧损伤的主要有效物质。其中已有实验研究表明，人参皂苷Rb1和麝香酮具有保护心肌细胞损伤的作用[10-12]，与笔者的研究结果一致。本研究初步明确了麝香保心丸在细胞水平具有保护心肌细胞损伤的作用及药效物质，为进一步研究其作用机制提供了依据。

图3 不同浓度的人参皂苷Rb1、Rb2、蟾毒灵和麝香酮对缺氧复-氧心肌细胞存活率的影响

【参考文献】

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