紧密连接蛋白claudin在食管癌中的表达及相关性研究

李 岩 姬明礼 李 兵

李岩:女，硕士，讲师

紧密连接是细胞连接结构中位于上皮细胞或内皮细胞最顶端的蛋白复合体，由闭锁蛋白(occludin)、claudins 和连接黏附分子(JAMs)等膜蛋白以及紧密黏连蛋白等胞浆蛋白组成，呈连续串珠状连接相邻的细胞，而起主要连接作用的是前二者，尤以claudins 的功能最为重要，它是构成紧密连接的主要骨架蛋白。目前普遍认为，细胞间黏附力丧失可导致细胞连接的破坏，与肿瘤细胞的浸润和转移有关。近年研究报道，claudin 蛋白的异常表达与肿瘤的转移有关［1］。食管癌是消化道常见恶性肿瘤之一，分子生物学研究表明，肿瘤的发生、发展是多阶段、多基因参与、多种转录因子调控的过程，涉及一系列病理生理反应，包括细胞的异常增殖、黏附、运动、细胞外基质降解、血管生成等［2］。我们检测了食管癌组织及健康食管组织中claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 的表达，以探讨其对食管癌浸润及转移的影响。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2011～2013年在某院食管癌术后病理标本共62例，男41例，女21例。年龄28～76 岁，中位年龄59 岁。均为鳞状细胞癌。均经病理检查确诊，术前均未进行过放化疗及其他生物学治疗。另取20例经病理检测为非食管癌的食管组织作为对照组。

1.2 方法 claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10兔多克隆抗体、DAB 试剂盒、免疫组化检测试剂、其他试剂均为国产分析纯。所有标本经10%的中性甲醛固定24 h，常规脱蜡后，在柠檬酸盐缓冲液中抗原高温修复20 min。用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min 1 次，连续3 次;3% H2O2室温下孵育10 min，用PBS 冲洗2 min 1 次;连续3 次，然后分别加入claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 抗体4 ℃放置8 h 以上。用PBS 冲洗2 min 1 次，连续3 次，滴加pv-9000试剂(聚合物辅助剂)20 min 后，用PBS 冲洗(2 min ×3 次)，滴加pv-9000 试剂二(辣根酶标记山羊抗兔/小鼠IgG 多聚体)20 min后用PBS 冲洗2 min 1 次，连续3 次，滴加DAB 液染色5 min，蒸溜水冲洗，苏木素复染5 min，盐酸乙醇脱色2 s，氨水中返蓝1 min，常规脱水，中性树胶封片。

1.3 判定标准 claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性。以阳性细胞所占比例(5 个高倍视野)分级。(-)为阴性表达;(+)为阳性表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0 统计软件，计数资料采用两独立样本的χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 两组病理标本claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 阳性表达率比较(表1，表2)

表1 两组病理标本claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 的阳性表达率比较例(%)

2.2 食管癌患者claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10的表达与临床病理特征(表2)

表2 食管癌患者claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 的表达与临床病理特征(例)

表1，表2可以看出，claudin-3、claudin-7、claudin-10在食管癌组织中阳性率高，正常食管上皮组织阳性率低。食管癌阳性率较正常食管上皮明显升高;且癌组织中claudin-3、claudin-7、claudin-10 的表达均与其分化程度相关，并随分化程度升高，阳性率明显升高。而在食管癌组织中伴有claudin-4 的表达下调，低分化组中claudin-4 的表达明显低于中- 高分化组。同时可以分析出，食管癌组织中claudin-3、claudin-7、claudin-10 的阳性表达呈正相关;而claudin-3、claudin-7、claudin-10 的表达均与claudin-4 呈负相关。

3 讨 论

正常分化组织的细胞组成是高度有序的，癌组织则通常缺乏这种特性，肿瘤细胞常常是分化变差、细胞极性消失及胞间紧密连接功能失常。紧密连接完整性的破坏可能是导致肿瘤细胞生长所需的营养因子及其他因子扩散的原因。食管鳞癌的发生通常经历从正常食管上皮-食管炎-异型增生-食管癌的系列演变过程［2］。紧密连接是维持上皮细胞内环境稳定的重要结构，claudin 蛋白是紧密连接结构与功能的重要组成成分。癌组织形成的主要特征是紧密连接的破坏、黏附性消失、细胞获得侵袭性和正常分化的缺失。不同的claudin成员以多种组合方式参与构成紧密连接，增加了紧密连接的结构和功能的多样性，为不同组织类型屏障功能的多样性提供了分子基础。claudin 在多种上皮来源的肿瘤中表达异常，推测其在这些肿瘤的发生及发展过程中可能发挥一定的作用［1］。

本研究发现claudin-3、claudin-7、claudin-10 在食管癌中的阳性表达率为分别为90.3%、95.5%、82.3%，较正常食管组织表达显著增强，差异有统计学意义(P ＜0.05)，提示claudin-3、claudin-7、claudin-10 蛋白过表达可能是食管癌发生的早期表现，可能与食管癌的发生有关，而且其表达程度与食管癌的分化程度呈正相关，因此又可以作为食管癌发展情况的分析指标。而claudin-4 与claudin-3、claudin-7、claudin-10 在正常组织和食管癌组织中均呈现负相关表达，差异有统计学意义(P ＜0.05)。另有研究表明随着claudin-4的表达减低，肿瘤的侵袭性不断增强。伴有claudin-4表达阴性患者的5年生存率明显低于表达阳性患者［3-4］。因此可以结合以上任一两组claudin 的表达情况，为临床诊断提供参考。

Claudin 蛋白及其他紧密连接蛋白的表达异常目前已被认为是细胞间黏附性丢失的机制和肿瘤细胞发生及转移的重要步骤，而这些步骤又可能在癌细胞的凝聚力降低、分化变差及侵袭性增加的过程中发挥了重要作用［5］。本研究结论提示深入开展这方面的研究有可能为食管鳞癌的抗转移治疗开辟一条新的途径。

［1］ 徐 冬.Claudin 蛋白与肿瘤关系的研究进展［J］.实用临床医学，2010，11(9):130-133.

［2］ Ding L，Lu Z，Lu Q，et al.The claudin family of proteins in human malignancy:a clinical perspective［J］.Cancer Manag Res，2013(5):367-375.

［3］ Lee KW，Lee NK，Kim JH，et al.Twist1 causes the transcriptional repression of claudin-4 with prognostic significance in esophageal cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，423 (3):454-460.

［4］ Xiang RL，Su YC，Pei XQ.Progress in functions of tight junction protein claudin-4［J］.Sheng Li ke Xue Jin Zhan，2012，43(4):310-314.

［5］ Sung CO，Han SY，Kim SH.Low expression of claudin-4 is associated with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2011，18(1):273-281.