不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用分析

关桂英 王风朝

不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用分析

关桂英 王风朝

目的 比较不同分子生物学方法检测手足口病标本的敏感性及应用价值。方法 选取山东莘县疾病预防控制中心2012年1月～2013年8月收集的100例手足口病标本为研究对象，根据分子生物学检测方法不同，将其分为巢式PCR组、一步法RT-PCR（逆转录-聚合酶链反应）组及实时RT-PCR组，对3组肠道病毒71型检测阳性率结果进行对比分析。结果 巢式PCR对住院标本、轻症标本及重死标本检测的EV71阳性率分别为84.62%、25%及83.33%，实时RT-PCR检测的80.77%、23.31%及77.78%，均明显高于一步法RT-PCR检测的15.38%、8.92%、44.44%，比较有统计学意义（P＜0.05)。结论 手足口病原体主要是EV71及CA16，且巢式PCR和实时RT-PCR生物检测敏感性相对一步法RT-PCR要高。

手足口病；巢式PCR；一步法；逆转录-聚合酶链反应

手足口病作为临床上一种常见传染疾病，多发病于儿童，特别是不足三岁的婴幼儿，易引发肺水肿、脑炎等并发症，严重者甚至死亡[1]。相关研究表明，肠道病毒71型（EV71）是引发手足口病的主要病原体，此外该病毒还易引起脑炎、无菌性脑膜炎等，危害性大[2]。本研究就此对本市人民医院100例手足口病标本采取3种不同分子生物学检测肠道病毒71型，比较不同分子生物学检测手足口病的敏感性及特点，为感染EV71的患儿及时治疗提供重要依据，报道具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取山东莘县疾病预防控制中心2012年1月～2013年8月收集的100例手足口病标本为研究对象，其中住院患者标本26例，轻症患者标本56例，重死患者标本18例。所有标本患者均符合《手足口病诊疗指南》[3]中对手足口病制定的诊断标准：（1）发热；（2）皮疹，且足底等部位出现水泡等症状；（3）口腔溃疡；（4）中枢神经系统相关症状。

1.2 检测方法

1.2.1 标本采集 实行无菌操作，手足口病患者发病后3～7d内采集1～2g粪便，保存在消毒灭菌后的专用盒内。利用干棉签对患者鼻咽部位进行正确的擦拭，采集完毕后马上放入专用试管中。上述标本均保存在-80℃冰箱中。

1.2.2 标本检测 严格按照病毒核酸提取试剂使用说明书操作，提取病毒。根据GenBank中常见EV端相关基因序列选择合理的引物，并利用相关软件辅助对肠道病毒VP1-VP3间进行EV71及CA16（肠道病毒柯萨奇）引物序列排列，不同引物产生不同的产物。对手足口病标本分别进行巢式PCR、一步法RT-PCR（逆转录-聚合酶链反应）及实时RT-PCR检测。RT-PCR反应条件：45摄氏度逆转录45min，94℃预变性2min/变性20s，45℃退火25s，然后72℃延伸30s，计36个循环。巢式PCR反应条件如上。实行病毒阳性率和阴性率对比试验，共试验3次。

巢式PCR及一步法RT-PCR采用琼脂糖凝胶电泳（1.5%）分析结果，实时RT-PCR利用荧光自动检测仪分析结果。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计学软件分析所得数据，正态计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

3组方法手足口病标本检测结果具体见表1。住院及重死标本中主要感染病毒为EV71，轻症标本主要感染病毒为CA16。且巢式PCR组EV71阳性率为：住院患者标本84.6%，轻症患者标本25%，重死患者标本83.33%；一步法RT-PCR组EV71阳性率为：住院患者标本15.38%，轻症患者标本8.92%，重死患者标本44.44%；实时RT-PCR组EV71阳性率为：住院患者标本80.77%，轻症患者标本23.21%，重死患者标本77.78%。巢式PCR及实时RT-PCR检测敏感性明显高于一步法RT-PCT方法，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 3种不同分子生物学方法检测手足口病阳性结果比较［n(%)］

3 讨论

最早在1957年就有人详细介绍过手足口病，次年相关研究人员从手足口病患者中分离出CA16[4]，随后1974年美国学者从脑炎患者标本中分离出EV71，自此临床上认为手足口病的主要病原体为CA16和EV71[5]。目前临床上检测手足口病的分子生物方法主要有巢式PCR、一步法RT-PCR及实时RT-PCR等，且不同分子生物学方法对手足口病标本检测的敏感性、特异性等是不同的[6]。

本研究对100例手足口病标本采取上述3种不同分子生物学方法检测。结果显示，巢式PCR对住院标本、轻症标本及重死标本检测的EV71阳性率分别为84.62%、25%及83.33%，实时RT-PCR检测的80.77%、23.31%及77.78%，均明显高于一步法RT-PCR检测的15.38%、8.92%、44.44%。一步法RT-PCR指的是将其中一条RNA链进行逆转录成为互补DNA，之后再以新形成的DNA链通过PCR进行复制[7]，以达到扩增的目的。实时RT-PCR则是在一定时间内通过DNA的增幅来进行定量分析。而巢式PCR共分为两步，第一步是将目标DNA模板蓝色的第一对引物结合起来，得到目的片段，第二步是使用第二套引物对第一步中经过PCR扩增的产物再次进行第二轮扩增。由于第一套引物在PCR产物的内部，而非目的片断一般不会同时包含两套引物，第二步的扩增过程中不会有非目的片段被扩增[8]。所以改种方法不会出现非特异性扩增所引发的污染问题，特异性较高，是目前扩增质量最高并且监测效果最好的一种方法。所得结果也与相关文献的结论一致。

由此可知，巢式PCR检测以及实时RT-PCR检测方法的敏感性明显高于一步法RT-PCR，均可作为手足口病标本检测的重要手段。

[1] 周俊新.手足口病发病影响因素调查研究[J].当代医学,2013,19(10): 163-164.

[2] 宫相翠,徐元芹,蒋艳，等.EV71相关手足口病合并肺水肿的体液免疫作用[J].当代医学,2012,18(28):92-93.

[3] 阎岩,王定明,胡静，等.3种分子生物学方法诊断手足口病的比较[J].贵州医药,2011,35(2):107-109.

[4] 侯佩强,张荣强,倪楠.2010年泰安市手足口病病原学检测分析[J].中华实验和临床感染病杂志(电子版),2012,3(5):209-211.

[5] 任倩.手足口病重要病毒序列分析及生物信息学表征[D].泰安:泰山医学院,2012：36-37.

[6] 张荣强,侯佩强,倪楠，等.泰安市2010～2012年手足口病不同标本检测结果分析[J].泰山医学院学报,2013,4(10):248-251.

[7] 周建芳,陈嘉臻,缪忻余，等.2010～2012年浙江省奉化市231例手足口病病原监测结果及病毒聚类分析[J].中国病毒病杂志,2013, 4(4):284-289.

[8] 吴世嘉.基于上转换荧光纳米探针的高灵敏微生物毒素检测方法研究[D].无锡:江南大学,2013：25-26.

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.22.102

山东 252400 山东莘县疾病预防控制中心检验科 （关桂英王风朝）