苹果梨醋发酵过程中醋酸发酵条件的优化

白龙律,尹振浩,尹成日*

(1.延边州产品质量检验所，吉林 延吉 133000； 2.延边大学理学院 化学系，吉林 延吉 133002)

延边苹果梨是我国优良梨品种之一，其果肉细脆、汁多，营养丰富[1].研究显示，苹果梨果肉中含蛋白质、脂肪、碳水化合物、钙、磷、铁、胡萝卜素、硫胺素、尼克酸、抗坏血酸等营养成分[2]，并且具有燥湿健脾、软化血管、止呕止泻、消痰止咳等保键功能[3].延边苹果梨资源丰富，但由于目前加工转化能力较低，苹果梨资源没能得以充分利用.研究[4]表明，果醋中含有丰富的有机酸、氨基酸、维生素及矿物质，具有食疗保健、美白护肤、抗病、抗衰老、抗疲劳等功能.目前，果醋的制备主要采用将果汁经过酒精发酵后，再进行乙酸发酵的微生物发酵法[5].醋酸菌是水果醋生产过程中最重要的因素.在20世纪以前，醋酸菌属分为两个属：一是可以将乙醇转化为醋酸的Gluconobacter[6]；二是可以将醋酸进一步氧化成二氧化碳和水的Acetobacter[7].进入20世纪后，通过生物基因研究和分子生物学分类法，醋酸菌被分为Ameyamaea,Acetobacter,Gluconobacter,Acidomonas,Gluconacetobacter,Asaia,Kozakia,Swaminathania,Saccharibacter,Neoasaia,Granulibacter,Tanticharoenia等12个属[8-9]，其中葡萄醋杆菌属(Gluconacetobacter)是醋酸菌科的一个重要菌属，一些葡萄醋杆菌如Ga.europaeus和Ga.entanii在工业醋特别是高酸度醋的发酵中具有重要作用[10].本文从5种水果样品中分离得到葡萄醋杆菌，并探讨了乙醇浓度、菌株接种量、发酵液有效体积对醋酸发酵的影响.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

苹果梨由吉林省延吉市华龙集团提供；乙醇为天津协和医学科技公司生产；溴甲酚紫为天津市大茂化学试剂厂生产；氢氧化钠为大连华中试剂厂生产,其他化学试剂均为分析纯.实验仪器有HZQ-C型全温振荡器(中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司)，LZDX-30型蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)，SPX-250B-Z型生化培养箱和BSC-1300 ⅡA/B3型生物安全柜(上海博迅实业有限公司医疗设备厂).

1.2 实验方法

1.2.1微生物的分离 取西瓜、红葡萄、柿子、苹果梨、草莓等5种样品，用粉碎机将各种水果样品粉碎制浆后，121 ℃灭菌20 min，然后在阴凉通风处放置7 d.待样品的pH值下降后，取1 g的样品溶于9 mL无菌蒸馏水中，将样品从10-1稀释到10-6.选取10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液，分别取0.1 mL用无菌三角棒将溶液均匀涂布在R2A、MRS、Nu、YM等平板培养基上，30 ℃下培养7 d.挑取单一菌落涂布于新鲜的培养基上培养3 d后，在4 ℃保藏备用.

1.2.2醋酸菌的筛选 取纯化培养的微生物转移到YEGA培养基中.由于每100 g YEGA培养基中含有30 mg的溴甲酚紫(指示剂的变色范围为pH 6.8紫色—pH 5.2黄色)，醋酸菌将培养基中的乙醇转化为醋酸时，醋酸菌周围的pH下降，导致菌落周围会生成黄色条带.因此，分离菌落周围出现黄色条带的菌株，用于下一步实验.

1.2.3高效醋酸菌的筛选 用接种环挑取2环醋酸菌菌体，接入100 mL液体培养基中，培养7 d后得到菌悬液，在4 ℃条件下冷藏备用.为了筛选出高产醋酸的高效菌株，将分离得到的醋酸菌在不同乙醇浓度、不同接种量、不同发酵液有效体积等3个条件下进行正交试验.通过正交试验筛选出的高效菌株，用于下一步苹果梨汁的发酵实验.具体条件参见表1.

表1 正交试验因素水平

1.2.4苹果梨醋的发酵 挑选发育成熟、果皮红润的苹果梨，去皮、去核后放入榨汁机制备苹果梨汁.将得到的苹果梨汁利用孔径为4 μm的滤膜过滤后，在紫外灯下照射15 min，然后在121 ℃条件下灭菌15 min.经灭菌后的粗果汁再利用孔径为0.6 μm滤膜过滤，得到苹果梨汁.

首先，利用实验室保藏的酵母菌对苹果梨汁进行酒精发酵.当苹果梨酒的酒精度达到正交试验的最佳酒精浓度时，取25 mL的菌悬液与100 mL苹果梨酒混合后放入250 mL锥形瓶中，在80 ℃灭菌15 min.然后，在灭菌的苹果梨酒中接种预先培养好的醋酸菌菌悬液，在30 ℃、120 r/min的恒温摇床中发酵得到苹果梨醋.最后，利用0.1 mol/L NaOH测定总酸的浓度.

1.2.5形态学鉴定 采用三点接种法，将菌株分别接种于YEGA培养基上，在30 ℃培养3 d后，肉眼观察菌落特征，并在显微镜下观察菌株的形态特征.

2 结果与讨论

2.1 微生物的分离筛选

在平板培养基中加入溴甲酚紫为指示剂，从上述5种水果样品中分离得到20种醋酸菌，其编号为AAB1-AAB20.

2.2 高效醋酸菌的筛选

从分离得到的20种醋酸菌中，筛选出一种高产醋酸菌.在菌株的初筛工作中，利用正交分析法在不同的乙醇浓度、菌株接种量、发酵液有效体积等条件下测定每个菌株的产酸能力，并筛选出高效醋酸菌AAB13.

图1为接种量为20%、发酵液有效体积为50%时不同浓度的乙醇对产酸量的影响.结果表明，乙醇浓度越高，产酸量达到最高值所需的时间越短.从图1中可以看出，当乙醇浓度为8%时发酵液中的产酸量达到最高值.因此，在苹果梨醋的发酵过程中将发酵液的乙醇浓度定为8%.

图1 初始乙醇浓度对醋酸发酵的影响

图2为乙醇体积浓度为8%、发酵液有效体积为50%时不同接种量对产酸量的影响.结果表明，接种量对发酵速度和产酸量的影响较大.当接种量为10%时，最高产酸量不及接种量20%和30%的产量；当接种量为30%时，虽然发酵周期短，但最终产酸量比接种量20%时低，这可能是由于过多的接种量使微生物大量繁殖，造成营养物质和溶解氧短缺，不利于发酵后期的代谢作用，从而影响了产物的生成量.因此，在苹果梨醋的发酵过程中醋酸菌的接种量定为20%.

图2 菌株接种量对醋酸发酵的影响

发酵液的有效体积直接影响发酵过程中溶解氧的浓度.溶解氧是微生物发酵过程中一个至关重要的参数，好氧微生物在进行深层培养时，需要适量的溶解氧以维持呼吸代谢和代谢产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，降低产量，但是过多的溶解氧会给微生物的生长带来不利影响.

图3为乙醇体积浓度为8%、接种量为20%时发酵液有效体积对产酸量的影响.结果表明，发酵液有效体积为50%时产酸效果最佳.利用正交分析法在不同乙醇浓度、菌株接种量、发酵液有效体积等条件下，测定每个菌株的产酸能力.在20种醋酸菌中，AAB13的产酸能力最为突出，并且在乙醇体积浓度为8%、菌株接种量为20%、发酵液有效体积为50%时其产酸量达到最高值.

图3 发酵液有效体积对醋酸发酵的影响

2.3 苹果梨醋的制备

乙醇的发酵利用本实验室保藏的酵母菌进行.酒精发酵结束后，以乙醇体积浓度为8%的苹果梨酒作为苹果梨醋发酵原料，利用高效菌株AAB13在30 ℃、120 r/min的恒温摇床中进行发酵.

经过正交试验表明，在分离得到的20种醋酸菌中，菌株AAB13在乙醇体积浓度为8%、接种量为20%、容器中发酵液体积为50%的条件下其产酸量最高，酸度达到5.3%.对发酵产物的主要理化指标进行测定，其结果如表2所示.

表2 理化指标测定结果

2.4 AAB13菌株的鉴定

AAB13菌株的形态学特征：AAB13菌侏在YEGA培养基上培养3 d，菌落平均直径为22 mm，菌落中心为浅黄色，边缘为白色，细胞呈杆状(图4).

图4 菌株AAB13的形态特征

菌株AAB13的16S rDNA测序结果如下：

CGCAGTGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTACGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCAGTCGCTGACCCGACCGTGGTCGGCTGCGCCCCTTGCGGGTTCGCTCACCGGCTTAAGGTCAAACCAACTCCCATGGTGTGATCACCCAGTCGCTGACCCGACCGTGGTCGGCTGCGCCCCTTGCGGGTTCGCTCACCGGCTTAAGGTCAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCACCTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTAGAGATCAGCACGATGTCACCATCTAGCTTCCCACTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGACATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTGTCACCGGCAGTCTCTCTAGAGTGCCCACCCAAACATGCTGGCAACTAAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTAGAGGTCCCTTGCGGGAAATATCCATCTCTGAATACAGCCTCTACATTCAAGCCCTGGTAAGGTTCTGCGCGCTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGCCG.

利用菌株AAB13的16S rDNA序列绘制系统发育树(图5)，从图中可以看出，菌株AAB13归属于葡糖醋杆菌属.

图5 菌株AAB13的系统发育树

3 结论

本实验从西瓜、葡萄、柿子、苹果梨、草莓等5种水果中分离出20种醋酸菌株AAB1-AAB20，其中菌株AAB13在起始乙醇体积浓度为8%、菌株加入量为20%、发酵液有效体积为50%的条件下，产酸量最高，酸度达到5.3%.通过分子生物学鉴定得知，菌株AAB13归属于葡糖醋杆菌属.

参考文献：

[1]李正英.苹果梨汁醋酸发酵过程中物质变化及其醋酸发酵饮料的研制[J].研究与探讨,2003,24(1):13-15.

[2]陈艳秋,曲柏宏,牛广才,等.苹果梨果实矿质元素含量及其品质效应的研究[J].吉林农业科学,2000,25(6):44-48.

[3]王治同,林柯,王立芳.苹果梨果醋饮料的研制[J].饮料工业,2010,13(2):9-12.

[4]蒋丽,周俊良,张兴无.果醋的研究现状及发展前景[J].中国调味品,2012,37(4):1-4.

[5]Vegas C,Mateo E,Gonzlez,et al. Population dynamics of acetic acid bacteria during traditional wine vinegar production[J]. International Journal of Food Microbiology,2010,138(1-2):130-136.

[6]Yamada Y,Yukphan P. Genera and species in acetic acid bacteria[J]. International Journal of Food Microbiology,2008,125(1):15-24.

[7]张忠明.高产醋酸菌的筛选及其形态生化特征研究[J].甘肃农业大学学报,2006,2(6):83-86.

[8]Junichi,Horiuchi,Tohrukanno. New vinegar production from onions[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,1999,8(1):107-109.

[9]Sengun I Y,Karabiyikli S. Importance of acetic acid bacteria in food industry[J]. Food Control,2011,22(5):647-656.

[10]Slapšak N,Cleenwerck I,De Vos P,et al.Gluconacetobactermaltacetisp. nov.,a novel vinegar producing acetic acid bacterium[J]. Systematic and Applied Microbiology,2013,36(1):17-21.