肿瘤坏死因子基因多态性与糖尿病视网膜病变关系的研究进展
2014-07-31庄淼综述姚勇审校
庄淼 综述 姚勇 审校
肿瘤坏死因子基因多态性与糖尿病视网膜病变关系的研究进展
庄淼 综述 姚勇 审校
糖尿病视网膜病变；肿瘤坏死因子；基因多态性
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见的的微血管并发症之一，是糖尿病患者视功能损害的根本原因。然而，其机制尚未完全明了。目前，DR被认为是一种受基因多态性影响的炎性疾病，肿瘤坏死因子是主要的炎症细胞因子之一，本文就肿瘤坏死因子的功能及其基因多态性与DR之间可能的关系作一综述。
[眼科新进展，2014，34(10)：993-996]
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最主要的微血管并发症之一，随着世界糖尿病人口日趋庞大，DR患者也日益增多，DR成为了全世界致盲的主要原因之一。2010年全球约有DR患者1.266亿，同时约有0.373亿患者视功能受到威胁，估计到2030年，DR患者将增加至1.910亿。而饱受DR所致视功能损害的患者将达到5630万[1]。这一庞大的数字突显了对DR进行研究的重要性和迫切性。
随着我国居民生活水平的日益提高，我国DR患者日渐增多，DR成为了我国继白内障、青光眼之后的又一主要致盲眼病。DR的发生、发展与众多危险因素有关[2-4]，其基因多态性方面更是近几年研究的热点。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)基因多态性也被纳入研究范围，现将近年来对TNF基因多态性与DR发生、发展关系的有关报道作如下综述。
1 TNF的基因多态性
人类TNF基因定位于6p21.4，长约3.6 kbp，有4个外显子和3个内含子，与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)基因紧密连锁位于HLA-B和HLA-C2位点之间的 MHC3 类基因区内，由TNFA和TNFB组成，分别编码TNF-α和TNF-β。TNF的基因具有多态性，这种多态性现象的标志是TNF-α与TNF-β基因内的碱基变化。
TNF基因多态性有两类，一类是微卫星多态性：TNF-α基因位点存在6种微卫星多态性，分别定义为TNFa、TNFb、TNFc、TNFd、TNFe和TNFf，TNFa为(GT)n重复，TNFb、TNFc、TNFd、TNFe均为(GA)n重复，TNFf为(CA)n重复。其中研究较多的是(GT)n的重复串联长度，它有18种，97～131 bp分别编号为B1到B18。TNF-β有2种微卫星多态性，分别为(GA)n和(GT)n。另一类是单核苷酸多态性(SNP)：TNF-α基因存在多个SNP多态性位点，主要有-1301、-863、-857、-575、-376、-308、-244和-238等，它们各自有着不同的碱基变换，-238、-244、-308、-376位点为G-A的碱基变换；-863位点为C-A的碱基变换、-1031位点为T-C的碱基变换、-857位点为C-T的碱基变化。TNF-β基因存在第一内含子+252位点(转录起始位点+252位点)和第三外显子区域内的804位点，其中前者为G-A多态性，后者为C-A多态性。
2 TNF与DR的关联性分析
2.1TNF的概念TNF于19世纪末被人们所发现，1984年首次被克隆。1985年Shalaby等[5]把巨噬细胞产生的TNF命名为TNF-α，把T淋巴细胞产生的淋巴毒素(lymphotoxin,LT)命名为TNF-β。
TNF-α是一种单核因子，主要由激活的单核细胞和巨噬细胞产生，TNF-α具有双重的生物学作用。正常水平的TNF-α可以调节免疫应答、抗感染、促进组织修复、引起肿瘤细胞凋亡等，但大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤[6]。
TNF-β是最早发现的细胞因子之一，LT是淋巴细胞受抗原或有丝分裂原等刺激活化后或在某些肿瘤、自身免疫疾病的情况下分泌产生的一种细胞因子。LT与TNF-α在分子结构和活性区域上相似。但其有抗肿瘤、抗病毒等生物学活性和潜在的药用价值，以及毒副作用低于TNF-α而引起关注。
2.2TNF在全身的表达早在1998年，Winkler等[7]通过对T2DM 患者、肥胖者及正常人这三组研究对象的血清TNF-α的浓度及生物活性进行测定，发现T2DM患者与肥胖者血清TNF-α浓度和生物活性均较正常人高。之后又有众多学者对不同地区的DR患者组与正常对照组的血清TNF-α浓度进行了测定，均发现DR患者血清TNF-α浓度较正常人高[8-9]。且进一步研究发现，血浆TNF-α浓度在正常对照组、糖尿病非视网膜病变患者组、非增生性DR患者组以及增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者组之间有递增的趋势[10-12]。Arita等[13]发现DR患者血清中膜性TNF-α、可溶性TNF-α以及它们的受体均较对照组显著升高。Zorena等[14]对患有1型糖尿病的儿童及成人进行研究，发现当TNF-α血浆浓度超过1.7 pg·mL-1时，会增加糖尿病微血管病变发生的可能性。Roy等[15]对非裔美国人1型糖尿病患者28种血清炎性生物指标进行测定比较，发现TNF-α与PDR的发生与发展均有密切关系。另外，当TNF-α基线大于3.4 pg·mL-1时，PDR发生的危险性会增加3～4倍。
2.3TNF在局部的表达2011年，Koskela等[16]通过研究发现，PDR患者血浆中IL-6、IL-8浓度低于玻璃体内，说明眼内的炎症因子高于全身。而同样作为重要的炎症因子，TNF是否也是如此呢？张洁等[17]通过研究发现，DR患者泪液中TNF-α水平增高，且其浓度在非糖尿病对照组、无DR的糖尿病患者组及DR患者组之间存在递增关系。Zhou等[18]对PDR组和对照组比较发现，PDR组TNF在眼内的浓度明显较对照组高，而且他们还发现，PDR患者眼内TNF水平与血浆HBA1C水平密切相关。然而，Gustavsson等[19]的研究并未发现眼内TNF-α水平的升高。Adamiec-mroczek等[20]通过研究发现PDR患者组玻璃体和血浆TNF-α浓度与对照组之间无统计学差异。综上所述，TNF-α在DR患者眼内表达水平可能存在地区、种族差异，导致结论不同，也有可能是样本量过小所致。TNF-α在DR患者眼内表达是否增加有待大样本、多种族、多地区的研究来验证。
2.4TNF在DR中的作用机制
2.4.1血-视网膜屏障受损在糖尿病患者中，高糖环境持续刺激机体，使机体代谢发生异常，视网膜毛细血管正常的结构和功能被破坏。这不仅造成了视网膜的损害，亦使之长期处于缺血、缺氧状态。这种缺氧刺激打破了视网膜血管生长因子和抑制因子间的平衡，使TNF-α分泌增加。TNF-α广泛分布于血管内皮细胞和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞表面，它通过打开视网膜血管内皮细胞和RPE细胞的紧密连接而致血-视网膜屏障破坏，进而使血管渗透性增加，而后者是使DR从非增殖期向增殖期转变的重要因素。Shirasawa等[21]对体外培养的RPE细胞予以不同浓度的TNF-α处理，以细胞跨上皮电阻作为评价指标进行研究，他们认为TNF-α破坏血-视网膜屏障可能是通过p38 MAPK途径实现的。
2.4.2引起视网膜新生血管TNF-α存在于PDR患者纤维血管膜浸润细胞、视网膜血管内皮细胞及细胞外基质中，是体外培养RPE细胞最强的有丝分裂原之一。TNF-α含量增加可以导致视网膜血管通透性增高，导致血清蛋白持续渗漏。另外，它还能通过激活促凝血酶原，抑制抗凝蛋白C旁路及合成纤溶激活剂抑制物，刺激血小板和内皮细胞释放血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)样有丝分裂原，引起基质过量产生和血管内皮细胞增生，最终导致眼内新生血管形成，促进PDR的发生。
2.4.3诱导细胞凋亡TNF-α与其受体结合后具有直接杀伤细胞、诱导神经元凋亡的作用。此外，它还可以通过其他生长因子如IGF-1和胰岛素受体等直接侵入细胞内而导致细胞凋亡。
Jiang等[22]在体外培养了视网膜内皮细胞，并对正常环境和高糖环境下的细胞予以TNF-α处理，通过比较，认为TNF-α通过调节胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)使视网膜内皮细胞凋亡，这一过程通过两种途径实现：一是TNF-α能增加胰岛素受体底物-1丝氨酸307(IRS-1Ser307)的磷酸化；二是TNF-α能增加细胞因子信号途径抑制物3(suppressor of cytokine signaling-3,SOCS3)水平，进而使总IRS-1减少，胰岛素受体酪氨酸960(IRTyr960)增加。这两种途径都阻断了正常的胰岛素信号转导，从而达到诱导细胞凋亡的目的。
2.4.4诱导炎症反应在DR的发生与发展中，炎症因子的参与具有重要作用。TNF-α属于炎症前细胞因子。DR是一种慢性长过程炎症反应，在病变起始阶段，炎症细胞因子如TNF-α、IL-1等，可促使血管内皮细胞表达黏附分子异常，增多的细胞因子使小胶质细胞活化，从而刺激炎症循环而使白细胞增加、黏附、聚集、移行，同时释放细胞毒性物质如自由基及蛋白水解酶，导致血管通透性改变及内皮细胞损伤，以致血管破坏，终致微血栓形成。
2.4.5作用于血小板TNF-α可诱导血小板释放血管活性分子并刺激血小板和内皮细胞释放PDGF样有丝分裂原，并刺激表达细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1),促使白细胞与内皮细胞的黏附、聚集。研究发现，PDR患者血清中血小板表达TNF-α、TNF-R及ICAM-1水平升高，说明TNF-α可作为糖尿病微血管并发症病程发展中血小板异常的重要标志。
2.4.6激活小胶质细胞有许多证据表明细胞因子在对小胶质细胞的活化中起作用,细胞因子如TNF、IL-1B、IL-6 等都有直接激活小胶质细胞的作用。TNF 可降低小胶质细胞中cAMP水平,进而直接激活小胶质细胞。活化的小胶质细胞进一步释放前炎症细胞因子及趋化因子，参与DR病变的代谢反应及炎症反应。
3 TNF基因与DR的关联性分析
3.1TNF基因SNP的相关研究随着TNF 水平升高在疾病中的意义越来越受到重视，TNF基因的重要性不言而喻。TNF在DR患者血液中的浓度明显较对照组高，也不难联想到调控TNF的基因是否与DR的发生发展有一定的关联。-308(rs1800629)位点位于TNF-α基因的启动子区，其多态性被认为与TNF-α的水平相关，-238(G-A)为在启动子区域转录起始位点上游第238 位点的碱基G被碱基A代替了,这一位点突变造成了限制性内切酶MspI 的识别位点的缺失,使被A替代的核苷酸序列不能被MspI识别并切断,即出现限制性片段长度多态性。这两个位点是近年来对TNF和DR相关性分析的主要切入点。Paine等[23]通过对493名志愿者(253例PDR患者及240例单纯糖尿病患者)的研究中观察到，-238A 在PDR患者组中出现的频率明显比对照组高，并认为-238A是PDR发病的潜在危险因素。Lindholm等[24]的研究数据表明LTA C60N C-A碱基变换、AGER-374 T-A碱基变换、TNF-308 G-A碱基变换与糖尿病微血管并发症(包括DR)有关。Wang等[25]考察rs1800629、rs1041981、rs2857713三个TNF相关基因，认为均与DR无关，Yoshioka等[26]对251例日本2型糖尿病患者进行的研究也显示，LTA的804C-A碱基变换、252A-G碱基变换以及TNF-α-308G-A碱基变换与DR无关。
3.2TNF基因微卫星多态性的相关研究Hawrami等[27]基于对南印度人群的研究发现，TNF-α微卫星多态性中，B9(112bp)在增生性DR和无视网膜病变者中的出现频率有显著差异(P=0.04)。Kumaramanickavel等[28]基于对印度人群的研究发现，B4在糖尿病非视网膜病变患者组和DR患者组间有显著差异(P=0.002)，他们还将研究群体细分为南印度、北印度两组，差异依旧显著(北印度P=0.003，南印度P=0.008)，因此他们认为B4(103 bp)是视网膜病变发展的低危因素；另外他们还发现B8和PDR有密切关系。Uthra等[29]通过对南印度人群的研究发现，(GT)15(即B10)是DR的危险因素之一。
4 展望
TNF-α是一种重要的前炎症因子，它有免疫应答、引起肿瘤细胞凋亡等重要作用[30]，在糖尿病患者眼内，它能通过破坏血-视网膜屏障、促进新生血管形成、诱导内皮细胞凋亡等途径，破坏正常的视功能，从而促进DR的发展。然而，TNF与DR之间尚有众多疑问有待解决。从发病角度来看，DR是一种多基因相关的病变，TNF作为众多细胞因子之一，它与其他细胞因子对DR的发生发展是否存在协同作用，甚至互相依赖作用，仍有待大量研究进行考证。从治疗角度看，TNF虽然在破坏视网膜细胞正常功能方面的作用已被证实，但是TNF抑制剂却很难只对眼内病变起作用而不引起全身反应，药物的剂量、剂型等依旧有待商榷。尽管如此，随着近几年对TNF作用与DR机制相关研究的深入，还是为临床治疗提供了不少新的思路。杨萍等[31]利用辛伐他汀对早期DR患者进行抗炎治疗，以TNF及视网膜改变作为评价依据，发现辛伐他汀可以降低患者血循环中炎症因子的水平，这可能是其改善DR的机制之一。
总之，TNF表达异常与其基因多态性有关。近几年，对TNF基因多态性的研究较多，然而结果却并不一致，这可能与种族差异、地区差异等环境因素有关。所以要完善TNF基因多态性与DR相关性的研究，还需要大样本、多种族、多地区的相关研究来证实，从而进一步指导未来的个体化基因治疗。
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date：Jan 16,2014
Recent advances in polymorphisms of TNF associated with diabetic retinopathy
ZHUANG Miao，YAO Yong
diabetic retinopathy;tumor necrosis factor;genetic polymorphism
Diabetic retinopathy (DR) is one of the most common diabetic microvascular complications,which is the main cause of vision impairment in diabetics.However,it’s mechanism has not been fully understood.Currently,DR is considered to be an inflammatory disease influenced by the gene polymorphism.Tumor necrosis factor (TNF) is one of the major inflammatory cytokines.This article reviews the functions of TNF and the possible relationship between the genetic polymorphism of TNF and DR.
庄淼，男，1990年6月出生，在读硕士研究生。联系电话：15195841281;E-mail：zm200204@163.com
AboutZHUANGMiao：Male,born in June,1990.Postgraduate student.Tel:15195841281;E-mail:zm200204@163.com
2014-01-16
214023 江苏省无锡市，南京医科大学附属无锡人民医院
庄淼，姚勇.肿瘤坏死因子基因多态性与糖尿病视网膜病变关系的研究进展[J].眼科新进展， 2014，34(10)：993-996.
10.13389/j.cnki.rao.2014.0276
【文献综述】
修回日期：2014-03-16
本文编辑：付中静
Accepteddate:Mar 16,2014
From theWuxiPeople’sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity，Wuxi214023，JiangsuProvince，China
[RecAdvOphthalmol，2014，34(10):993-996]
