耐福美双桑氏链霉菌生物型的选育1)

2014-07-27朱天辉李姝江安晓龙

东北林业大学学报 2014年7期

关键词：福美核菌悬液

余琴朱天辉李姝江安晓龙

(四川农业大学，雅安，625000)

耐福美双桑氏链霉菌生物型的选育1)

余琴朱天辉李姝江安晓龙

(四川农业大学，雅安，625000)

为选育抗药性桑氏链霉菌(Streptomycessampsonii)，采用紫外线照射与药物培养基驯化结合法，筛选出MV-1、MV-2、MV-3、MV-4、MV-5等5株能在含有200 mg/L福美双的培养基上生长的抗性突变株。结果显示：出发原菌株KJ40对福美双最敏感，EC50为12.82 mg/L，致死浓度为40 mg/L。5株突变株中，MV-2和MV-5的EC50值最高，为129.28 mg/L，抗性水平最高，达10.09；MV-1最低，EC50为100.13 mg/L，抗性水平7.81。通过抑菌效果测定发现，MV-2和MV-4对紫丝核菌(Rhizoctoniacrocorum)抑菌力显著高于KJ40，抑菌率为80.39%和76.08%，分别比KJ40提高了10.59%和6.28%；MV-5无抑菌效果；MV-1和MV-3对病原菌的抑菌效果与KJ40无显著差异。拮抗活性高于亲本的MV-2和MV-4与福美双协同使用，抑菌效果高于菌株和福美双药液单独使用。

桑氏链霉菌；抗福美双；紫外线诱变

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-133～136，142

We screened out five mutation strains resistant to thiram of MV-1, MV-2, MV-3, MV-4 and MV-5 by the combination methods of UV irradiation and medical cultivation to select the thiram-resistant mutants ofStreptomycessampsonii. Among the tested strains ofStreptomycessampsonii, KJ40 was the most sensitive to thiram, the EC50was 12.82 μg/mL, the lethal concentration was 40 μg/mL. The resistant level of MV-2 and MV-5 were the highest between the thiram-resistant strains, and the EC50and the resistant level were 129.28 μg/mL and 10.09, respectively. The resistance level of MV-1 was the lowest, and the EC50and the resistant level were 100.13 μg/mL and 7.81, respectively. By determining inhibiting effect, inhibition activities of MV-2 and MV-4 were more significant than their parental strains, and the inhibition rate reached 80.39% and 76.08%, respectively. Compared with KJ40, the inhibition rates were improved by 10.59% and 6.28%, respectively. MV-5 had no antibacterial effect onRhizoctoniacrocorum. Compared with the parental strains, there were no significant changes in inhibition activities of mv-1 and mv-3. By using the mixed of Thiram and Thiram-resistant mutants with the strongest inhibition activity, the inhibiting effect was more than that of thiram-resistant mutantsor and thiram alone.

KeywordsStreptomycessampsonii; Thiram-resistant; Mutation by UV irradiation

随着近代对化学农药的过度依赖，很多病原真菌对化学农药产生了强烈的抗药性，更进一步导致了化学农药的滥用，对全球的环境健康和食品安全构成了巨大威胁。目前，应用生物防治控制植物病害已经越来越受到世界各国的重视，筛选有益微生物、由生防微生物开发的农药已成为国内外生物防治研究的热点。但能够实际应用到植物病害防治上的还很少。四川农业大学林学院森林保护实验室从杨树根系分离得到了一株对杨树紫丝核菌(Rhizoctoniacrocorum)有抑制作用的StreptomycessampsoniiKJ40[1]。国内对桑氏链霉菌的研究较少，Jain等[2]从花园的土壤中分离得到具有抗真菌活性桑氏链霉菌菌株。野生链霉菌株对农药的抗药性差，当施用农药后对具生防作用的菌株也有杀灭效果，造成生防作用下降或者无明显生防作用。报道显示[3]，生防菌和化学农药混合使用，不仅可以降低农药的使用量，减轻对环境的污染，还因为化学杀菌剂的使用削弱了病原菌的生长，使其对生防菌更加敏感，从而提高了生防菌的防治效果。实现生防菌和化学农药综合利用的前提是生防菌对化学农药要有一定的耐药性。本研究采用紫外线照射与药物培养基驯化相结合的方法，选育对福美双具有抗性的桑氏链霉菌突变菌株，通过筛选获得抗福美双突变株，并对抗福美双突变株的生防特性进行了分析研究，为突变菌株在生产上的应用奠定基础。

1 材料与方法

桑氏链霉菌KJ40菌株(以下简称链霉菌KJ40)和杨树紫纹羽病病原菌紫丝核菌由四川农业大学林学院森林保护实验室提供。40%福美双可湿性粉剂购自山东潍坊万盛生物农药有限公司。牛肉膏蛋白胨培养基用于放线菌的培养，其配比为葡萄糖10 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、琼脂粉20 g、NaC 15 g、水1 L，pH=7.0～7.2。PDA培养基用于拮抗性测定，其配比为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 L，pH自然。

福美双对链霉菌孢子致死浓度的测定：链霉菌KJ40斜面25 ℃培养2 d，将其制备成106～107个/mL的孢子悬液。取1 mL制备好的出发菌株孢子悬液分别涂布于含福美双1、5、10、50、100、200 mg/L的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，以不加福美双的处理为对照，置于恒温培养箱中25 ℃培养。2 d后逐日观察记载菌落的生长情况。凡是在前一个低浓度平板上长出菌落而在后一个较高浓度平板上未长出菌落的，后一浓度即为福美双对出发菌株孢子的致死浓度[4]。

紫外线诱变：将出发菌株接种于斜面牛肉膏蛋白胨培养基中，25 ℃恒温培养活化2 d，将其制备成孢子悬液。取1 mL菌悬液按照梯度稀释法[5]稀释为10-3、10-4、10-5。吸取不同稀释梯度的菌悬液分别涂布在平板上，于30 W紫外灯下诱变30 s。25 ℃恒温黑暗培养3 d后计算菌落数，以未经紫外线诱变菌株的涂布培养结果为对照，统计菌落数，计算紫外诱变后的致死率，确定最佳的诱变菌悬稀释液浓度。将确定的最佳诱变浓度菌悬液吸取1 mL涂布在平板上，30 W紫外灯下诱变10、20、30、60、120 s，25 ℃恒温黑暗培养3 d后计算菌落数。试验以不进行紫外诱变的平板为对照，并以致死率在60%～90%[6]确定最佳诱变时间。

抗福美双突变株的筛选：将突变株接入斜面进行培养保存。再将得到的突变株平板划线培养后转入斜面2～3 d，将其制备成孢子悬液。吸取1 mL制备好的孢子悬液分别涂布于含福美双40 mg/L的培养基平板上，30 W紫外灯下诱变30 s，每处理重复3次，25 ℃恒温黑暗培养3 d后计算菌落数。3 d后逐日观察记载菌落生长情况。凡是在平板上长出菌落的，即为抗福美双40 mg/L的突变菌株。如此反复，逐步提高药剂浓度直到在福美双200 mg/L的长出菌株。计算菌落数并将单菌落挑接于斜面上，25 ℃培养，待斜面孢子丰满，置于冰箱中，4 ℃保存。

抗性突变株对福美双的抗性水平测定：将原KJ40菌株和5株突变株制成孢子悬液，取1 mL到含福美双10、20、30、40、50、100、150、200 mg/L的牛肉膏蛋白胨平板上[7]，置于恒温箱中，25 ℃黑暗条件下培养。4 d后通过菌落计数法计数[8]，以不加福美双的处理为对照，每个处理重复3次。通过抑菌率值和各有效药剂浓度对数值之间的线性回归分析[9]，求出各菌株的EC50值。以敏感菌株KJ40为对照。抗性突变体的抗性水平=抗性突变体的EC50值/敏感菌株KJ40的EC50值。

抗福美双突变株对杨树紫丝核菌的抑菌效果：通过平板对峙法[6]测定出KJ40和突变菌株的抑菌效果。在直径90 mm的PDA平板中心接种活化后的直径5 mm的紫丝核菌，在PDA平板距中心25 mm对称的4点接种直径5 mm的KJ40和抗福美双的突变菌株。25 ℃培养5 d后，观察记录抑菌情况，测定抑菌带宽度，3次重复。

福美双和突变株协同对紫丝核菌的抑菌效果：将KJ40和突变菌株在福美双50 mg/L PDA平板距中心25 mm对称的两侧划线培养。以不加福美双药液单独处理为对照。菌丝生长抑制率=((对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径)×100%。式中，菌落直径=测量菌落直径-5.0。

抗性突变株的遗传稳定性：将经过福美双诱变获得的具有抑菌作用的抗性突变株继代转管10次以上，再转移至含200 mg/L福美双的平板上，25 ℃恒温培养，2～3 d后观察对福美双抗性的稳定性。

2 结果与分析

2.1 福美双对链霉菌孢子的致死浓度

由表1可知，福美双对菌株KJ40孢子的致死浓度为40 mg/L，以此为菌株KJ40抗药性致死突变标志。将在40 mg/L长出的5株耐药菌株平板划线培养后保存。

表1 福美双对菌株KJ40孢子的致死浓度

2.2 紫外线诱变

2.2.1 最适菌体稀释浓度

以菌株KJ40为出发菌株，对其不同浓度的菌悬液进行30 W紫外灯下30 s诱变，诱变结果见表2。由表2可知，随着菌悬液浓度的降低，致死率逐渐升高，由于高剂量可能造成更多负突变株，所以选择致死率为60%～90%的剂量诱变。因此，确定最适的诱变菌悬液稀释浓度为10-3。

表2 不同稀释浓度菌悬液的紫外线诱变结果

2.2.2 最适诱变时间

以菌悬液稀释浓度10-3为最适诱变浓度，进行30 W紫外灯下不同时间诱变，诱变时间与菌落数变化关系如表3所示。由表3可知，随着诱变时间的增长，存活菌落数逐渐减少，致死率逐渐增加，依据致死率为60%～90%，确定最适诱变时间为30 s，此时致死率为85.38%。

表3 紫外线诱变时间对菌悬液的影响

2.3 抗福美双突变株的筛选

通过紫外线诱变与药剂驯化相结合的方法对亲本桑氏链霉菌菌株KJ40进行反复诱导，最终得到5个能在福美双质量浓度为200 mg/L的培养基上生长并产孢的突变菌株(图1)。突变株外部形态无较大变化，但在含药平板上菌落数变少且生长速度变缓，4d后才开始生长。将筛选出的突变株命名为ΜV-1、ΜV-2、ΜV-3、ΜV-4、ΜV-5，在含药200 mg/L平板上分别生长出菌落数为46.67±7.50、380.67±89.37、213.67±24.58、10.00±8.02、211.00±12.53，KJ40无菌落生长。

1.KJ40；2.MV-3；3.KJ40的孢子，×400；4.MV-3的孢子，×400；5.MV-2的孢子，×400；6.MV-4的孢子，×400。

图1 福美双200 mg/L质量浓度下菌株生长情况

2.3.1 突变株对福美双的抗性水平

将KJ40和突变株对福美双进行抗性水平测定。结果表明(表4)，KJ40的EC50值为12.82 mg/L，和抗福美双突变株的EC50值存在显著差异。在抗性突变株中，MV-2和MV-5的EC50值最大，为129.28 mg/L，其次是MV-3，EC50为124.50 mg/L。MV-1的EC50值最小，为100.13 mg/L。以亲本KJ40菌株为敏感对照菌株，以各抗性突变株的EC50值与亲本对照菌株的EC50值之比计算了各抗福美双突变株的抗性水平。结果显示，MV-2和MV-5的抗性水平最高，达到10.09，其次是MV-3，抗性水平为9.71，抗性水平最低的是MV-1，抗性水平为7.81。

表4 桑式链霉菌不同突变株对福美双的抗性水平

注：采用Duncan多重比较法分析，同一列不同字母表示差异显著(P<0.05，n=3)。

2.3.2 突变株对杨树紫丝核菌的抑菌效果

通过紫外线诱变和药剂驯化后，拮抗菌对杨树紫纹羽病菌的拮抗效果发生显著变化(表5)。有的突变株拮抗活性减弱，如ΜV-5，对杨树紫纹羽病菌无抑制效果；有的突变株对菌丝的拮抗活性无显著变化，如ΜV-1和ΜV-3。有的突变株拮抗活性增强，如ΜV-2的抑菌率80.39%与KJ40的69.80%相比，提高了10.59%；MV-4提高了6.28%，提高了抑菌效果。选择防效最好的MV-2、MV-4突变株研究其与福美双对紫丝核菌的协同作用。

表5 抗药性桑氏链霉菌对杨树紫纹羽病菌的抑制效果

注：病原菌菌落直径数据为平均值±标准差，采用Duncan多重比较法分析，同一列不同字母表示差异显著(P<0.05，n=3)。

福美双和MV-2、MV-4协同对紫丝核菌的抑菌效果见图2。亲本KJ40无法在福美双50 mg/L平板上生长。紫丝核菌在50 mg/L含药平板上基本无法拓展生长(图2e)。在MV-2、MV-4和福美双协同作用时，紫丝核菌无法生长(图2f和图2g)。结果表明，福美双和链霉菌协同使用对紫丝核菌的抑菌作用与单独使用链霉菌和福美双药液有明显提高。

a.杨树紫纹羽病菌在不含药平板上的生长情况；b.KJ40对杨树紫纹羽病菌的抑菌效果；c.MV-4对杨树紫纹羽病菌的抑菌效果；d.MV-2对杨树紫纹羽病菌的抑菌效果；e.杨树紫纹羽病菌在50 mg/L含药平板上的生长情况；f.MV-4在50 mg/L含药平板上对杨树紫纹羽病菌的抑制效果；g.MV-2在50 mg/L含药平板上对杨树紫纹羽病菌的抑制效果。

图2 不同菌株对杨树紫纹羽病菌的抑菌情况

2.3.3 突变株的遗传稳定性

将经过福美双诱变获得的抗性突变株继代转管10次以上，再转移至含福美双50、100、150、200 mg/L的平板上，突变株菌落均能够生长和产孢，且对病原菌的抑制效果不变。这说明突变株的抗药性和拮抗性较为稳定和持久。

3 结论与讨论

由于各种诱变剂对微生物的作用位点和方式不尽相同，因此，反复使用同一诱变因子会出现钝化现象，可能引起微生物的回复突变。在链霉菌的诱变育种上，采用两种或两种以上的方式进行诱变育种已经取得了很好的效果[10-12]。本试验通过紫外线诱变和含药培养基驯化相结合的方法，具有一定的方向性(抗药性)，筛选出对福美双高抗的突变性菌株。通过亲本KJ40菌株和突变菌株做抗性水平测定，KJ40的致死浓度为40 mg/L福美双药液，EC50值为12.82 mg/L；各突变株能在200 mg/L上长出菌落，EC50值100.13～128.28 mg/L，突变株对KJ40抗性水平为7.81～10.09，其中抗性水平最高的为MV-2和MV-5达到了10.09。说明通过紫外线诱变和含药培养基驯化相结合的方法可以明显提高链霉菌的抗药性。继代转管10次以上，再转移至含药平板上，突变株菌落均能够生长和产孢，且对病原菌的抑制效果不变。这说明突变株的抗药性和拮抗性较为稳定和持久。

绝大多数的高产抗生素产生菌都使用过紫外线诱变育种，且有很好的效果[13-15]。但对拮抗菌生物活性的影响却是随机的，有的抑制作用增强，有的抑制作用减弱甚至没有抑制作用。如ΜV-2与KJ40的抑菌率相比，提高了10.59%，MV-5无抑菌效果。

实现生防菌和化学农药综合利用的前提是生防菌对化学农药要有一定的耐药性。本试验筛选出突变株ΜV-2、ΜV-4对福美双具有高抗性且对病原菌的抑制作用有所提高；福美双和链霉菌协同使用对紫丝核菌的抑菌作用与单独使用链霉菌和福美双药液有明显提高。有效降低了放线菌对化学药剂的敏感性、增大了放线菌的生防潜能，使生防放线菌与杀菌剂协同效应在综合防治体系中的应用成为可能。

[1] 朱天辉,李姝江,雷美艳,等.桑氏链霉菌KJ40菌株及其液体制剂:中国,201210122697[P].2012-10-03[2014-4-8].http://www.aptchina.com/zhuanli/7835083/.

[2] Jain P K, Jain P C. Isolation, characterization and antifungal activity of Streptomyces sampsoniiGS 1322[J]. Indian Journal of Experimental Biology,2007,45(2):203-206.

[3] 田连生,冯树波.耐药性木霉菌株的筛选及其对灰霉病的防治[J].生物技术,2005,15(5):26-28.

[4] 涂璇,刘霞,涂晓嵘等.NTG诱变农抗702产生菌链霉菌702的研究[J].生物技术,2010,20(1):36-39.

[5] 刘桂杰.紫外线诱变育种提高土霉素菌种的生产能力[J].中国医药工业杂志,1997,28(3):118-120.

[6] 贾翠英,张玉辉,吴志洋.紫外线诱变与羧甲基半胱氨酸复合筛选高产L-精氨酸菌株[J].核农学报,2012,26(6):879-883.

[7] 齐永霞,陈方新,李增智.白僵菌抗多菌灵突变株的诱变及生物学特性研究[J].核农学报,2012,26(1):68-72.

[8] 方中达.植病研究方法[M].北京:农业出版社,1979:174-175.

[9] 慕立义.植物化学保护研究方法[M].北京:中国农业出版社,1994:39-75.

[10] 张建勇,牛晋阳,陈贵斌,等.新型抗生素AGPM产生菌藤黄灰链霉菌的诱变育种[J].微生物学通报,2003,30(2):24-28.

[11] 王金发,孔小卫,张晓魁,等.紫外线和亚硫酸氢钠对龟裂链霉菌原生质体的诱变作用[J].中国抗生素杂志,1989,14(2):86-88.

[12] 李永泉,贺筱蓉.微波诱变和激光诱变相结合选育金霉素链霉菌的研究[J].生物工程学报,1998,14(4):445-448.

[13] 黄世文,余柳青.淡紫灰吸水链霉菌及其紫外诱变菌株用于害物生防研究[J].农业生物技术学报,2000,8(1):79-84.

[14] 黄永春,曹仁林,彭祎.紫外诱变吸水链霉菌选育高产农用抗生素菌株[J].安徽农业科学,2008,36(16):6847-6848.