Gasbench Ⅱ-IRMS测定新鲜橙汁水中氧同位素方法

徐胜，钟其顶，王道兵

（1.农夫山泉股份有限公司，浙江杭州310007；2.中国食品发酵工业研究院，北京100027；3.全国食品发酵标准化中心，北京100027）

目前国家标准GB/T 21731-2008《橙汁及橙汁饮料》虽然明确规定了非复原橙汁和复原橙汁的定义，尚未建立非复原橙汁和复原橙汁的有效鉴别配套技术方法。国际上通常采用橙汁中水的氧（18O/16O，记作δ18O）同位素比值作为NFC橙汁真实性鉴别特征指标[1-6]。如欧洲果蔬汁协会（AIJN）采用橙汁中水的δ18O值作为NFC橙汁和FC橙汁鉴别指标，其中美国官方分析化学家协会（AOAC）和欧盟委员会（CEN）先后制订了测定（浓缩）橙汁水中δ18O的检测方法标准。国内牛丽影和钟其顶等人初步探讨了水中δ18O在国内NFC橙汁真实性识别中的应用，研究表明NFC橙汁水中δ18O明显区别于复原橙汁[7-8]。

目前，AOAC和CEN等测定橙汁水中δ18O的标准方法主要采用离线二氧化碳-水平衡法[9]，但该分析方法不仅存在样品量大，劳动强度大，对实验人员的要求高等特点，且无法实现全自动进样，分析效率低，难以满足大规模连续测定。在线二氧化碳-水平衡系统在近年来得到快速发展，Debajyoti Paul和Grzegorz Skrzypek研究了不同因素对GasBench-IRMS测定二氧化碳中δ18O时稳定性与准确性的影响，并对实验条件进行了优化[10]；孙青等人应用GasBench II-IRMS分析天然水样中δ18O，稳定性与准确性均比较理想[11]；张琳等人对离线水平衡-双路进样法和GasBench IIIRMS进行了比较，结果表明两种方法测定水中δ18O的精密度和准确度基本一致，均能得到较好的分析数据[12]。本文通过优化方法参数，建立GasBench-IRMS测定橙汁中（尤其是新鲜橙汁）水的δ18O方法，探讨在大规模连续进样测定橙汁中水的δ18O在线分析系统。

1 材料方法

1.1 仪器和主要试剂

GasBenchII前处理装置配备：GCPAL自动进样器，PoraPlotQ色谱柱（25m×0.32mm），恒温样品盘（温度精度±0.1℃），硼硅酸盐反应瓶（12mL），进样针和吹气针。

检测器为Delta V advantage（美国Thermo Finnigan公司），仪器控制软件为ISODATE 3.0。

高纯He、CO2标准气和0.3%CO2+He混合气，铜丝，活性碳粉末，乙醇（色谱纯）。

1.2 实验样品

新鲜橙子采自安远养生堂脐橙种植基地，去皮后榨汁，用三层纱布过滤后待测。

1.3 实验方法

设定恒温样品盘温度27℃，He压力为80 kPa。在样品瓶中加入铜丝和活性炭，加入样品后放入恒温样品盘。固定进样针和吹气针，设定自动进样器程序，充0.3%的CO2+He混合气10 min，带走瓶中的空气。设定样品充气与样品分析之间的间隔，使气体CO2与水中氧发生同位素交换[13]。用质谱仪测定平衡后的CO2同位素比值。

1.4 结果表示

采用相对测量法表示物品中18O/16O，结果以δ（千分差，‰）表示

式中：R样品为样品中18O与16O的比值；R标准为标准物质VSMOW中18O与16O比值，18O/16O=（2 005.20±0.43）×10-6。

1.5 数据校正

样品测定过程中插入质控水样和标准水样，依据Stephen等[14]报道的VSMOW/SLAP校正法进行校正。

2 结果与讨论

2.1 参考气分析精度

连续流-稳定同位素比值质谱仪测定时，参考气分析精度的好坏直接影响样品的分析精度和准确度。对于水中氧同位素分析，控制二氧化碳参考气同位素分析内精度至关重要。连续10次通入参考气，测定标准偏差（σ）＜0.015‰（见表1）；改变参考气进样量（以信号强度表示），测定值的变化率为-0.035‰/V（见表2）。表1和表2数据表明仪器的内精度符合测定要求，而CO2的进样量在1 V～10 V变化时，δ18O分析结果不受影响。

系统内精度数据见表1，信号强度对δ18O的影响见表2。

表1 IRMS系统内精度δ18O（‰）Table 1 Inter-precision for δ18O analysis

表2 δ18O（‰）与信号强度的关系Table 2 Influence of intensities on the determination of δ18O

2.2 进样系统稳定性

样品瓶内气体由进样针导入GasBench，CO2经色谱柱分离纯化后由八通阀导入IRMS中，连续进样10次，测定值的标准偏差1-σ＜0.08‰（见表3），满足同位素测定要求。

GasBench II-IRMS测定δ18O的进样稳定性数据见表3。

表3 进样系统稳定性δ18O（‰）Table 3 Inlet system stability for δ18O analysis

2.3 影响因素分析

2.3.1 样品瓶气密性

文献[10]报道超过24 h时瓶内CO2中δ18O呈现偏重趋势，即反应瓶气密性变化导致瓶内气体渗漏继而出现同位素分馏。本实验表明52 h之内CO2中δ18O值恒定（见图1），这说明本研究所选择的反应瓶能够保证至少52 h内不出现同位素分馏。

测定时间对δ18O的影响见图1。

图1 反应瓶气密性验证Fig.1 Gastight test of vial

2.3.2 样品体积的影响

孙青的研究表明样品水体积对δ18O的分析结果有明显干扰，当样品水量较大时，测量值受体积的影响较小，而样品水量较小时，测量值受体积的影响较大[11]。本研究分别向样品瓶中加入0.2、0.5、1 mL橙汁样品，结果（见表4）表明不同体积的橙汁样品对水中δ18O的分析结果没有明显干扰，即由于橙汁样品水中氧的量远远超过平衡物质CO2物质的量，平衡体系中CO2的初始同位素比值对分析结果没有影响。

样品体积对δ18O的影响见表4。

表4 样品体积对水中δ18O（‰）测定的影响Table 4 Influence of sample volume on δ18O determination

2.3.3 平衡时间的选择

CO2/He混合气与水发生氧同位素交换，分别在12、16、20、24、32、40、48、72 h 时测定，反应时间在12 h～24 h时测得的氧同位素值比较偏负，且呈现逐渐偏正的趋势，这表明水与CO2还未完全达到同位素平衡；反应24 h～72 h时测得的结果比较接近（见图2）。

图2 反应时间对葡萄酒水中δ18O的影响Fig.2 Influence of equilibrium time on δ18O determination

2.3.4 乙醇及发酵对橙汁水中δ18O测定的影响

GasBench-IRMS的应用优势在于可不间断测定大量样品，由于同位素交换反应和样品测定间隔的缘故，样品在反应瓶中等待最少24 h、最多48 h才能进行测定，在此过程中橙汁（尤其是鲜橙汁）存在发酵的可能，然而发酵产生的CO2会严重影响水中δ18O的测定[15]。为研究橙汁自然发酵对测定的影响，分别对橙汁样品按表5进行处理。

果汁发酵产生的CO2对δ18O的影响见表5。

表5 发酵对水中δ18O测定的影响Table 5 Influence of fermentation on the determination of δ18O

结果表明A组（反应瓶内有橙汁和CO2-He混合气）中CO2的信号强度明显增加，但增加的程度不同，这可能是由于待测过程中的先后顺序不同导致反应瓶内样品的发酵程度有差异；B中加入了乙醇，CO2的含量相对稳定且信号强度仅有9.5 V；向C和D中加入相同质量的酵母，另向C中加入乙醇，由表5可知D中CO2的信号强度明显大于50 V，超过了IRMS的测定线性范围；相对D，C中CO2信号强度显著降低，仅比B高一点，这说明乙醇抑制酵母发酵的作用显著。

为验证乙醇对δ18O测定的影响，配制体积分数为0、5%、10%、15%、20%的乙醇水溶液，测定其水中δ18O（见表6），结果乙醇浓度在0%～20%范围内时不影响水中δ18O的测定稳定性及结果准确性，因此可选用乙醇作为橙汁水中δ18O测定过程中的发酵抑制剂。

乙醇浓度对水中δ18O测定的影响见表6。

表6 乙醇溶液中的水中δ18OTable 6 δ18O-value of water in ethanol-water solution

2.4 方法稳定性

采用IRMS与GasBench II联用，利用CO2-H2O平衡在线连续分析新鲜橙汁中氧稳定同位素组成，方法为：恒温样品盘温度为27℃，He压力80 kPa，0.5 mL橙汁样品中加入活性碳、铜丝和0.05 mL乙醇后与0.3%CO2+He混合气与平衡24 h～48 h，用质谱仪测定同位素交换平衡后CO2中δ18O，用标准水样校正测定结果。

2.4.1 精密度

对同一橙汁样品重复测定5次（见表7），橙汁水中δ18O的1-σ＜0.1‰。

GasBench II-IRMS测定果汁水中δ18O的精密度。

表7 水中δ18O（‰）精密度试验结果Table 7 The precision of δ18O-value analysis of water in juices

2.4.2 再现性

选择同一橙汁样品每隔一周测定一次（见表8），1-σ＜0.1‰。

GasBench II-IRMS测定果汁水中δ18O的再现性结果见表8。

表8 水中δ18O（‰）再现性试验结果Table 8 Reproducibility of δ18O-value of water in juices

由此可知，本法测定新鲜橙汁水中δ18O的精密度与再现性指标均比较理想，符合样品水中δ18O测定的要求。

3 结论

本研究建立了GasBench II-IRMS测定橙汁氧同位素组成的在线分析方法：应用GasBench II设备对样品进行水-CO2平衡，通过加入乙醇可有效抑制待测过程中果汁发酵，最后用IRMS测定CO2中δ18O并计算得出样品水中δ18O。该法测定精密度和稳定性良好，稳定性高，相对于其他方法操作简便、分析快速，适合果汁行业和检测系统的大规模样品测定，为我国建立NFC果汁技术标准体系提供科学方法支撑。

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