微波辅助浸提马齿苋活性成分的工艺

2014-07-26秦爱丽沈君琪陈凌童孟新邵华李鑫伟

食品研究与开发 2014年12期

秦爱丽，沈君琪，陈凌，童孟新，邵华，李鑫伟

（嘉兴职业技术学院生物与环境分院，浙江嘉兴314036）

马齿苋（Porlulaca oleracea L.）属马齿苋科一年生肉质草本植物，具有抗菌、降血脂、抗衰老、松弛肌肉、抗炎、镇痛以及促进伤口愈合等功效[1-6]。马齿苋既可入药，又可食用，是我国卫生部划定的78种药食同源的野生植物之一。国外许多学者研究了马齿苋的抗菌作用[7-12]，国内也有不少学者对马齿苋提取物的研究表明它具有杀菌作用，如用马齿苋煎煮液，口服治疗急性胃肠道感染性疾病不仅对致病菌有直接杀伤作用，而且直接补充和纠正了因呕吐和腹泻所引起的胃肠液大量丢失及酸碱失衡[13]；马齿苋水煎剂体外抗菌实验结果显示对6种常见致病菌有明显的抑菌作用[14]等。国际上，食品添加剂的发展趋向是天然、营养和功能化方面发展，而马齿苋提取物符合这些条件，它有可能成为一种天然无毒的多功能食品防腐剂。本文采用微波辅助热水浸提、乙醇浸提法提取马齿苋活性成分，用正交试验对提取条件进行优化，以期寻找最佳提取工艺条件，为该珍贵野生植物资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生马齿苋，采于嘉兴职业技术学院校园内，经嘉兴职业技术学院陈玉琴副教授鉴定。将新鲜马齿苋全草洗净，晾至表面无水分，于80℃恒温干燥，取出后粉碎，石油醚脱脂，35℃烘干备用。95%酒精、葡萄糖、浓硫酸、苯酚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸氢钠均为分析纯：上海联试化工试剂有限公司；芦丁、没食子酸：国药集团化学试剂有限公司；Folin-Ciocalteu试剂：上海荔达生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

RE-52C型旋转蒸发仪：巩义市英峪高科仪器厂；DK-S24型恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；722分光光度计：上海海争电子科技有限公司；赛多利斯电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；格兰仕G80W23CSL-A6K微波炉：广东格兰仕集团公司；202-2A数显电热恒温干燥箱：杭州蓝天化验仪器厂；Smartpark DQ3纯水柱，D-Q-3超纯水仪等。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

单因素实验：马齿苋粉→加溶剂微波辅助浸提→离心分离→上清液→浓缩→冷冻干燥→称重。

正交试验：马齿苋粉→加溶剂微波辅助浸提→离心分离→上清液→浓缩→定容→测含量。

1.3.2 单因素实验

影响马齿苋活性成分提取率的主要因素有提取剂、提取温度、浸提时间、固液比和提取次数等。本实验称取马齿苋粉3.000 g，置于三角瓶中，按料液比（干粉重量∶溶剂，g/mL）1∶30按以下步骤加入溶剂提取。各水平试验3次取平均值。

1）提取溶剂的选择：马齿苋粉分别加入纯水、60%酒精、95%酒精，放入微波炉中，在功率350 W条件下提取2 min后，于40℃的水浴中浸提30 min。浓缩提取液，冷冻干燥，称重。

2）水浴浸提温度的选择：马齿苋粉加入纯水，放入微波炉中，在功率350 W条件下提取2 min后，分别置于40、50、70℃的水浴中浸提1 h。浓缩提取液，冷冻干燥，称重。

3）水浴浸提时间的选择：马齿苋粉加入纯水，放入微波炉中，在功率350 W条件下提取2 min后，分别置于50℃的水浴中浸提30 min、1 h和2 h。浓缩提取液，冷冻干燥，称重。

1.3.3 正交试验

根据单因素实验结果，选取料液比、微波时间、微波功率和浸提次数作为考察因素，各取3个水平，进行正交实验设计，优化马齿苋活性成分的提取工艺条件。

1.4 活性成分含量测定

马齿苋活性成分含量的测定主要测其葡萄糖、酚类、黄酮的含量，测定方法如下：

1）采用苯酚一硫酸法，以葡萄糖作为标准品，分光光度计测定其多糖含量；

2）采用Folin-Ciocalteu方法，以没食子酸为标准品，比色法测定其总酚的含量；

3）采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法，以芦丁为对照品，分光光度计测定马齿苋黄酮的含量。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 提取溶剂对提取率的影响

浸提溶剂对提取率的影响见表1。

表1 浸提溶剂对提取率的影响Table 1 Extraction solvents on extraction rate

由表1可知，提取溶剂为95%酒精时的提取率最高，但与水浸提相差不是很大，考虑到提取成本，选用纯水作为提取溶剂。95%酒精的提取率最高，这与活性成分主要是有机物有关，根据相似相溶原理有机物易溶于有机溶剂；而60%酒精的提取率最低，是因为此提取剂中水与酒精形成氢键，而使浸提液与马齿苋活性成分的作用力减弱，使其提取率降于纯水。

2.1.2 浸提温度对提取率的影响

浸提温度对提取率的影响见表2。

表2 浸提温度对提取率的影响Table 2 Extraction temperature on the extraction rate influence

由表2可知，提取剂为水时浸提温度为70℃时提取率最高，50℃时最低。升高温度，渗透、扩散、溶解速度加快，有利于活性成分转移至水中，提取率随之提高；但温度升高，挥发性成分也随着挥发，使提取率降低，50℃时提取率最低说明此温度下挥发性活性成分挥发。虽然70℃提取率明显高于40℃的提取率，但考虑到能耗，选用40℃作为浸提温度。

2.1.3 浸提时间对提取率的影响

浸提时间对提取率的影响见表3。

表3 浸提时间对提取率的影响Table 3 Extraction time on extraction rate influence

从表3可见，50℃时水浸提，浸提时间120 min的得率最高，但与30 min时的相差很小，60 min时提提取率最低。考虑到效率问题，选用30 min浸提时间。时间过短，活性成分还未充分溶出，但当时间过长，活性成分的溶出量变化不大，这是由于提取时间过长，提取液内有效成分浓度已达到平衡。再者挥发性物质的挥发量增加，反而使提取率降低。

单因子实验的结果：用纯水作为提取剂，在40℃浸提30 min为最佳选择。

2.2 正交试验分析

2.2.1 正交试验

称取马齿苋1.000 g，用纯水在40℃浸提30 min，活性成分以多糖、酚类、黄酮提取率的总和为考察指标，选定4个因素3个水平进行正交试验，因素水平见表4，正交试验结果见表5。

表4 多糖提取正交试验因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal of polysaccharides extraction

表5 试验设计方案因素水平表L9（34）Table 5 Table of factors level of design plan

从表5可以看出，用纯水浸提马齿苋活性成分，各因素对活性成分得率的影响大小顺序为：料液比＞微波时间＞浸提次数＞微波功率，即A＞C＞D＞B。由于微波功率对浸提效果的影响最小，考虑到能耗，选择350 W。综合分析得出最佳工艺条件为：料液比1∶50、微波1 min、浸提1次、微波功率350 W。

2.2.2 提取液中活性成分的含量

2.2.2.1 多糖含量

精密称取105℃干燥恒重的葡萄糖标准品0.2 g，用蒸馏水溶解至100 mL容量瓶中定容，吸取5 mL此溶液再定容于100 mL容量瓶中，得到浓度为0.1 g/L的标准葡萄糖溶液。准确吸取标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL 分别置于比色管中，加蒸馏水使体积为1.0mL，再加入体积分数6%的苯酚溶液1mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置至室温，用分光光度法于490 nm处测定吸光度A，以糖浓度（c）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的回归方程是：A=0.560 7c+0.040 0，相关系数R2=0.997 9。

分别取正交试验的9种浸提液，按作标准曲线的同样步骤测其吸光度，将A带入回归方程求得多糖浓度（c），然后计算出多糖得率（见表5）。

2.2.2.2 黄酮的含量

精密称取芦丁对照品200 mg，用体积分数70%乙醇溶解，定容到100 mL容量瓶中，摇匀，精密吸取10 mL，置于100 mL容量瓶中，用水定容，得到0.2 g/L的标准溶液。用移液管准确吸取 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL的芦丁标准液分别置于10 mL的比色管中，加入水1 mL，加入5%亚硝酸钠0.4 mL，摇匀，放置 6 min，加入10%硝酸铝 0.4 mL，摇匀，放置6 min，加入4.3%氢氧化钠4.0 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以试剂空白为参比，用分光光度计在500 nm处测定吸光度（A），以芦丁浓度（c）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的回归方程：A=0.944 6c+0.017，相关系数 R2=0.999 5。

同样分别取正交试验的9种浸提液，按作标准曲线的同样步骤测其吸光度，带入回归方程求得芦丁浓度（c），然后计算出黄酮得率（见表5）。

2.2.2.3 酚类的含量测定

取没食子酸0.2 g，蒸馏水溶解，且迅速定容到100 mL的容量瓶内，得2.0 mg/mL没食子酸溶液。在从中移取10 mL没食子酸溶液于100 mL容量瓶内，并加入蒸馏水，定容到100 mL，作为没食子酸标准溶液。精密吸取 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 没食子酸标准溶液，迅速加入0.6mL Folin-Ciocalteu试剂混匀，3 min后加入10%Na2CO3溶液1.5 mL，加入蒸馏水定容到10 mL。30℃避光反应2 h，在750 nm处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为：A=8.580 8c+0.274 6，相关系数 R2=0.999 1。

取上述九种浸提液1 mL于比色管内，同上述步骤测其吸光度，同理计算出酚类得率（见表5）。由表5可知：马齿苋的水提物的主要成分是多糖，黄酮的含量很少，酚类的含量更少。