紫色甘薯原花青素抑菌效果的研究

2014-07-26陈婵丁玲黄琼彭宏

食品研究与开发 2014年12期

陈婵，丁玲，黄琼，彭宏

（福建农业职业技术学院，福建福州350119）

紫色甘薯由于富含花青素等一类对人体营养的保健物质而在近年被认定为特用品种。近年来的研究表明，从紫色甘薯的块根中浸提的色素是一种优质的天然食用花青素类色素，色泽鲜亮自然，无毒，无特殊气味，具有多种营养、药理和保健功能[1-3]。

甘薯块根花青素具有色素和抑菌双重功能，是理想的功能性天然色素。目前已有人初探了有关甘薯花青素抑菌活性，如王关林[4]等研究了甘薯花青素的提取及其抑菌效果分析，结果表明了甘薯块根花青素对3种常见致病菌均有抑菌作用，并与其浓度呈正相关。古荣鑫[5]等用涂布涂板法对花青素抑菌活性进行初步测定，结果表明：发现花青素对大肠杆菌的生长有明显的抑制作用。本文进一步深入研究了紫色甘薯原花青素对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及青霉菌等几种常见有害菌的抑菌作用，主要研究了不同质量浓度的紫色甘薯原花青素对供试菌的抑菌效果，并比较了紫色甘薯原花青素和尼泊金乙酯、苯甲酸钠、山梨酸钾等常见食品防腐剂的抑菌效果，为紫色甘薯原花青素今后的进一步开发及应用提供了理论参考，也为寻找天然防腐剂提供新的理论参考。

1 材料及仪器

1.1 材料

紫色甘薯；市售。

甲醇、正丁醇、盐酸、硫酸铁铵、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、尼铂金乙酯钠、山梨酸钾、苯甲酸钠均为分析纯。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、青霉菌由福建农业职业技术学院微生物实验室提供。

1.2 仪器

JA1103电子天平：上海民桥电子仪器厂；722可见光度计：上海天翔光学仪器有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱：上海申贤恒温设备厂；LDZX-40A1压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；BCM-1300A生物洁净型标准洁净工作台：广州市深华实验仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫色甘薯原花青素的提取及制备

选用新鲜，无病虫害，无腐烂的紫色甘薯，用水洗净，去皮，称取一定重量的紫色甘薯，粉碎，置于试管中各加入5 mL 80%乙醇溶液，然后置于60℃的恒温水浴锅中，加热2 h，取上清液，再用80%乙醇溶液定容到25 mL容量瓶中，备用。

1.3.2 紫色甘薯原花青素的测定方法

取上述溶液0.2 mL分别置于6支具塞比色管中，各加入甲醇溶液至1.0 mL然后加入6.0 mL正丁醇/盐酸（95/5，体积比）和0.2 mL 2%盐酸铁胺溶液（临时配用），摇匀后，于沸水中加热40 min，然后迅速冷却，在550 nm测定吸光度。

1.3.3 菌体的培养方法

1.3.3.1 培养基的制备方法

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的制备（100 mL），牛肉膏 0.3 g～0.5 g，琼脂 2.0 g，蛋白胨 1.0 g，氯化钠 0.5 g，蒸馏水100 mL，调pH在7.2～7.4之间，并在121℃下灭菌30 min。待冷却后，倒入无菌培养皿。

马铃薯培养基的制备（100 mL），马铃薯切成小块，称30 g，加适量的蒸馏水在电炉上煮沸煮烂，过滤得滤液，然后准确称取2 g蔗糖和2 g琼脂加适量蒸馏水和马铃薯溶液混合后加水至100 mL后将其加热融化，分装后，121℃灭菌25 min。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。

1.3.3.2 菌种的活化及菌悬液的制备

在无菌室的超净工作台上将供试菌种接至各自的试管斜面培养基中，放入恒温培养箱进行培养，其中细菌 37℃，24 h～36 h；霉菌 29℃，48 h～60 h。在无菌室的超净工作台上，用接种环分别挑取少量活化的菌种放入无菌水中，制成菌体或孢子浓度为104CFU/mL～105CFU/mL的菌悬液，用振荡器震荡均匀，备用。

1.3.3.3 抑菌圈大小的测定[6-7]

抑菌圈的测定采用滤纸片扩散法。将普通滤纸用打孔器打成直径为6 mm的滤纸片，放入干燥洁净的培养皿内，经121℃，20 min高压灭菌后放入干燥箱内干燥.将干燥后的滤纸片一部分放入不同浓度的紫色甘薯原花青素溶液中浸泡1 h制成药敏纸片备用，另一部分放入无菌生理盐水中和80%的乙醇溶液中浸泡做空白对照。在超净工作台上将灭菌后的培养基倒平板，分别取菌体密度104cfu/mL的菌悬液0.2 mL均匀涂布于各平板上，待30 min后，用无菌镊子夹取备好的滤纸片紧贴在含菌培养基表面，每皿等距贴2片。每种浓度设3个重复，将平板倒置于一定温度下一定时间后取出，用卡尺测量抑菌圈直径.

1.3.4 紫色甘薯原花青素对不同供试菌的抑菌作用

选用直径为6 cm的培养皿，每皿加大约15 mL经灭菌处理的培养基，待冷却凝固后，放置于培养箱中观察24 h，然后将有杂菌生长的培养皿废弃，在无杂菌生长的培养基中每皿加入供试菌悬液0.2 mL，涂布均匀后，用无菌镊子夹取制备好的滤纸片贴于含菌培养基上，每皿放置2片，各纸片间的距离均等，每一样品重复3次，倒置培养。同时用浸有无菌水的滤纸片以及80%乙醇作空白对照.其中细菌37℃，24h～36h；霉菌29℃，48 h～60 h。观察抑菌圈，用游标卡尺量取各个培养皿的抑菌圈直径，抑菌圈直径越大，抗菌活性越强。

1.3.5 不同质量浓度紫色甘薯原花青素对不同菌的抑菌作用[8-9]

根据1.3.1的方法提取紫色甘薯原花青素，备用。把紫色甘薯原花青素在无菌条件下配成质量浓度为5、10、15、20、30 mg／mL 的原花青素溶液，同时设空白对照组。按照1.3.4的方法测量不同浓度的抑菌圈直径，得出不同质量浓度的紫色甘薯原花青素抑菌作用的强弱。

1.3.6 紫色甘薯原花青素与尼泊金乙酯、苯甲酸钠、山梨酸钾抑菌效果比较

根据1.3.1的方法提取紫色甘薯原花青素，制成10 mg/mL的原花青素溶液，备用。分别配制0.5 μg/mL尼泊金乙酯以及5 μg/mL苯甲酸钠、山梨酸钾溶液，摇匀，备用。

将培养基倾注无菌平皿。冷却后，用无菌移液管吸取0.2 mL菌悬液至平板上，用无菌三角玻璃涂棒涂布均匀。待干后，将小滤纸片分别置于紫色甘薯原花青素、尼泊金乙酯、苯甲酸钠、山梨酸钾溶液中浸泡，晾干，放入平板中。倒置于恒温培养箱培养一定时间（其中细菌 37℃，24 h～36 h；霉菌 29℃，48 h～60 h）。最后测定抑菌圈直径大小。

1.3.7 数据分析与处理

采用DPS2000对数据进行统计分析，采用Duncan新复极差法对实验数据进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 紫色甘薯原花青素含量的测定

经线性回归方程可得：测定紫色甘薯原花青素含量的公式为Y=0.055 3A-2.488×10-3，相关系数R2=0.999 0。可计算紫色甘薯原花青素的质量浓度。

2.2 紫色甘薯原花青素对不同供试菌抑菌作用的影响

表1列出了质量浓度为10 mg/mL紫色甘薯原花青素溶液对不同致病菌的抑菌效果。

表1 10 mg/mL紫色甘薯原花青素对不同供试菌抑菌作用的影响Table 1 Inhibition efect of 10 mg/mL purple sweet potato proanthocyandins against the tested microorganisms

结果表明：对照组无菌生理盐水对4种受试菌没有抑菌作用，而80%的乙醇溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌有一定的抑菌圈，对青霉菌没有抑菌作用，而紫色甘薯原花青素对供试菌却有较好的抑菌效果，每种菌的抑菌效果各异。其中，同浓度下紫色甘薯原花青素对沙门氏菌的抑菌效果最好，抑菌圈达到17.1 mm；对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为14.4和15.5 mm；对青霉菌没有抑菌效果。由此得出紫色甘薯原花青素的抑菌效果为沙门氏菌＜金黄色葡萄球菌＜大肠杆菌＜青霉菌。

2.3 不同质量浓度紫色甘薯原花青素对不同供试菌抑菌效果

表2列出了不同质量浓度紫色甘薯原花青素对不同供试菌抑菌效果。

表2 不同质量浓度紫色甘薯原花青素对供试菌的抑菌效果Table 2 Inhibition effect of different concentrations on purple sweet potato proanthocyandins against the tested microorganisms

从表2得出不同质量浓度紫色甘薯原花青素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌作用随着原花青素浓度的提高，抑菌圈增大，抑菌作用增强。而对青霉菌而言，只有高浓度的紫色甘薯原花青素才对青霉菌有一定的抑菌作用。由此可知：紫色甘薯原花青素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌作用的抑菌效果是与紫色甘薯原花青素浓度的成正相关，当浓度增加时，抑菌效果也越好。

2.4 比较紫色甘薯原花青素与尼泊金乙酯纳、苯甲酸钠、山梨酸钾对不同供试菌的抑菌效果

尼泊金乙酯纳、苯甲酸钠、山梨酸钾均为食品中常见的添加剂，本文参照食品添加剂的使用用量配制一定浓度的添加剂溶液作为紫色甘薯原花青素的阳性对照。其中尼泊金乙酯配制为0.5 μg/mL，苯甲酸钠、山梨酸钾配制为5 μg/mL。表3比较了10 mg/mL的紫色甘薯原花青素与三种常用添加剂对不同供试菌的抑菌效果。

表3 紫色甘薯原花青素、尼泊金乙酯、苯甲酸钠、山梨酸抑菌作用的比较Table 3 The comparison of inhibitory effect on purple sweet potato proanthocyandins，ethylparaben，sodium benzoate and sorbic acid mm

结果表明紫色甘薯原花青素对所试大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌具有较好的抑制作用，抑菌圈直径均为15 mm以上，抑菌效果显著，抑菌效果随着不同供试菌的不同而有所不同，虽然10 mg/mL紫色甘薯原花青素的抑菌效果不如浓度为5 μg/mL山梨酸钾，但与5 μg/mL苯甲酸钠与0.5 μg/mL尼泊金乙酯的抑菌效果相当，该数据为紫色甘薯原花青素的抑菌能力提供了理论依据。但紫色甘薯原花青素对青霉菌没有抑菌作用，而其他阳性对照都有较好的抑菌圈，说明紫色甘薯原花青素对霉菌的抑菌效果不理想。