超声波萃取-HPLC检测饮料中DEHP的含量

刘燕伟，周真巡，赵文峰，马彤梅，*

（1.华南理工大学化学与化工学院，广东广州510640；2.江苏师范大学化学化工学院，江苏徐州211116）

“塑化剂”又称为邻苯二甲酸酯类（PAEs），是一种被广泛使用的工业增塑剂。PAEs主要用作增加塑料的可塑性和韧性，也可使油脂更好地分散到水中，起乳化、增稠作用[1]。PAEs其对人体的危害性远远大于三聚氰胺[2-4]，在体内长期积累会导致畸形、癌变和突变[5-6]；而其中的邻苯二甲酸二（2-乙基）己基酯（DEHP）对幼儿带来的潜在危害会更大，食用后果可能会造成小孩性别错乱，包括生殖器变短小、性征不明显[7]。

塑化剂与塑料分子的相溶性较好，两者间没有严密的化学结合键，而是由氢键或范德华力连接，彼此保持各自独立的化学性质。当塑料制品接触到水、油脂等时，其中的塑化剂便会迁移入水中，从而造成了对水、食物等污染[1，8-9]。目前，市场上很多饮料都采用塑料瓶包装，在为消费者提供方便的同时也带来了食品安全隐患。

目前，检测食品及塑料制品中PAEs含量的方法较多，而检测饮料中PAEs的方法较少，其中检测DEHP的方法更少。因此，建立一种快速、简便测定饮料中DEHP含量的方法是很必要的。目前国内外测定食品中DEHP主要采用的检测方法是GC/MS[10-12]，我国的国标也采用该方法[13]。GC/MS具有重复性好、定性准确等优点[14]，但由于GC/MS价格昂贵，且其检测器容易受污染等原因，越来越多的研究者开始使用HPLC技术检测样品中DEHP的含量[15-16]，且HPLC适用于检测DEHP等具有高沸点的化合物。目前，常见提取样品中塑化剂主要有超声波辅助提取[17]、索氏萃取[18]、微波提取[19-20]、快速溶剂萃取[21]等技术，为了使样品中塑化剂提取得更充分，通常需要较长的处理时间。

本研究建立了采用超声波辅助水浴提取-HPLC检测饮料中DEHP的含量。水浴加热超声提取取代室温条件下提取饮料中的DEHP，极大地缩短了超声时间、提高了萃取效率。采用HPLC-UV检测提取液中DEHP的含量，取得了满意的实验结果。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Summit 680型高效液相色谱仪（紫外检测器，美国 Dionex Inc）；Pyramid水系 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm，北京振翔公司）；离心机（TDL-80-2B，上海安亭科学仪器厂）；旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）；超声清洗器（KQ-100E，昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（Sartorius，赛多利斯科学仪器有限公司）；过滤膜（Nylon66 0.22 μm，上海全岛公司）。

邻苯二甲酸二（2-乙基）己基酯（DEHP）为标准品（Sigma公司，色谱纯），乙腈、甲醇（天津四友公司，色谱纯），正己烷、丙酮、乙酸乙酯、环己烷、盐酸、氢氧化钠均为分析纯试剂。所用水为二次蒸馏水，所用玻璃仪器均在二次蒸馏水冲洗后，烘干5 h。本试验避免使用塑料器具。

1.2 标准溶液的配置

称量10 mg的DEHP标品于10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，配置1 000 mg/L的储备液。将储备液用甲醇稀释，分别配置浓度为 0.05、0.5、1、2、5 mg/L 的系列标准溶液。

1.3 液相色谱条件

Pyramid水系 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流动相：乙腈与水（体积比为 95 ∶5），流速：0.6 mL/min，柱温：30℃，检测波长为 224 nm，进样量：20 μL；

1.4 样品的前处理

量取体积为2 mL的样品置于三角烧瓶中，分别加入0.06 g氯化钠，5 mL的正己烷于40℃的水温下超声波辅助提取10 min，在3 500 r/min下离心15 min；取上层正己烷提取液2 mL，在低于40℃的条件下，旋转蒸发至干后用甲醇溶解定容于2 mL的容量瓶中。经0.22 μm滤膜过滤，注入HPLC色谱仪中。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 提取液的选择

DEHP难溶于水，易溶于乙腈、甲醇等有机溶剂。本文考察了乙腈、甲醇、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂对样品中DEHP的提取效果，结果见图1。

图1 溶剂的选择Fig.1 Effect of extracting solvent

结果表明：在同样的实验条件下，使用正己烷作为提取液，效果更好。

2.1.2 盐效应影响

NaCl通过盐析作用可以促使样品中DEHP进入正己烷层。本实验通过分别向样品中加入0～0.1 g的NaCl，考察加入盐的量对提取DEHP效果的影响。实验结果表明，加入0.06 g的NaCl时，得到的目标物含量较高。结果见图2。

图2 NaCl盐效应的影响Fig.2 Salting effect of NaCl

2.1.3 提取液体积的选择

本实验在2 mL样品体积中，加入正己烷提取液的体积在3 mL～7 mL范围内变化，通过对提取效果的比较，选择最佳正己烷的体积。实验结果表明，当加入正己烷的体积为5 mL时，提取目标物的含量最高。结果见图3。

图3 不同体积正己烷的影响Fig.3 Effect of the volume of n-hexane

2.1.4 超声时间的选择

本实验采用超声波辅助提取技术，超声提取速度快、容易操作。文献报道一定超声条件可导致PAEs降解[22]。因此，我们在采用超声提取时，注意控制超声频率、功率及超声时间。在室温的条件下，超声35 min，提取效果最佳。温度的提高可以加速DEHP的提取，本实验又考察了控温在40℃的条件下，超声10 min达到的效果优于在不控温下超声35 min的结果，但将温度继续升至60℃时，萃取的效果反而下降。图4所示，本实验采用的超声提取条件为超声频率40 kHz，功率200 W，控温40℃下，超声提取10 min。

图4 不同温控和不同超声时间的影响Fig.4 Effect of the ultrasonic time and temperature

2.1.5 溶液pH的影响

在一定的条件下，溶液酸碱性影响着有机化合物的提取。在本实验中，考察具有不同的pH条件下，对DEHP提取效果的影响。实验结果见图5可知，当pH为5时，提取效果最佳。

2.1.6 离心时间的影响

一般情况下，离心时间增长，有助于样品的分离和净化。但离心时间过长时，目标物可能会聚沉，反而不利于样品的分离。因此，分别对样品采取在5 min～25 min不同范围的离心时间进行考察。实验表明，在3 500 rpm的条件下离心15 min效果最佳。结果见图6。

图5 不同pH条件下的提取效果Fig.5 Effect of pH on extraction efficency

图6 不同离心时间的影响Fig.6 Effect of the centrifugal time

2.2 标准曲线

在最优实验条件下，分别对浓度为 0.05、0.5、1、2、5 mg/L的标准溶液进样得到相应的液相色谱图，图7不同浓度标准溶液的液相色谱图。图8中，以DEHP浓度（mg/L）为横坐标，以对应浓度的峰面积为纵坐标，拟合线性回归方程为Y=0.749 45*X+0.072 83，相关系数R为0.999 95。结果表明：该方法在0.05 mg/L～5 mg/L的浓度范围内线性相关性良好；由3倍信噪比（S/N=3），得到该方法中DEHP的最低检测限（LOD）为0.000 5 mg/L。

图7 不同浓度的DEHP标准溶液的色谱图Fig.7 Chromatograms of standard solution of DEHP

图8 DEHP标准溶液的标准曲线Fig.8 Calibration curve of standard DEHP

2.3 添加回收率和精密度

准确添加不同浓度DEHP的标准溶液至样品中，按照1.4所述对样品进行处理，在优化的实验条件下进液相色谱仪测定，考察方法的精密度（RSD）和回收率，得到方法的回收率在90.2%～101%之间，RSD为2.32%～5.17%之间。结果如表1所示，每个添加水平做7次平行实验。

表1 不同添加水平下饮用水中DEHP的回收率及RSD（n=7）Table 1 Recoveries and RSD of DEHP in the water with different amounts（n=7）

我们将本实验采用的方法与已经报道的一些常用检测各类饮料中DEHP方法的最低检测限和RSD进行比较，如表2所示。

表2 本实验与已有文献检测方法的比较Table 2 Comparison of the presented method with some previously reported works

通过对比表明多数研究小组采用MS检测方法测定饮料中的DEHP，而我们采用成本较低的HPLC；同时我们的实验方法得到非常低的检测限，适用于检测DEHP含量较低的饮料，且本实验有较好的RSD，对检测饮料中DEHP的含量具有一定的可靠性。

2.4 实际样品的测定

在最优实验条件下，将处理好的实际样品进高效液相色谱仪，得到液相色谱图，图9中（a）为汽水样品的色谱图，（b）为汽水样品中加标的色谱图。通过加标样品和标准溶液进液相色谱，从而确定该饮料样品色谱图中目标峰的出峰时间为14.70 min，定量其浓度为0.289 mg/L。由图9可知，本文建立的方法能够实现样品中DEHP与基体中其他组分很好的分离。

图9 汽水样品（a）及其加标样品（b）液相色谱图Fig.9 Liquid chromatograms of drinks（a）and adding standard（b）

我们用建立的方法分析了多种不同类型饮料样品，每个样品做7次平行实验，检测结果见表3。

表3 各类饮料样品的分析结果（n=7）Table 3 Analytical results of several different kinds of drink samples（n=7）

实验结果表明汽水饮料样品中DEHP的检测含量在0.127 mg/L～0.289 mg/L之间，RSD 为 3.43%～6.31%之间。本实验对塑料瓶和易拉罐不同包装的汽水均检测出少量的DEHP，而塑料包装的汽水中DEHP的含量约为易拉罐包装的2倍。易拉罐包装的汽水中的DEHP可能是由于在生产过程中接触到塑料材质而引入的。

3 结论

本文建立了加热超声提取-HPLC方法检测饮料中DEHP的含量。40℃下加热辅助超声萃取具有缩短了萃取时间、提高了萃取效果等优势。实验结果表明，DEHP在0.05 mg/L～5 mg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数R=0.999 95；检测限为0.000 5 mg/L；加标回收率为90.2%～101%；相对标准偏差（RSD）为2.32%～5.17%。该方法简便、快速、可靠、高灵敏、分离度较好等特点，适用于饮料中DEHP含量的测定。

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