环孢霉素A对心肌缺血-再灌注损伤的保护机制和治疗进展

朱可夫 综述 王宁夫 审校

(浙江中医药大学 杭州市第一人民医院心内科，杭州浙江 310053)

尽管对于心肌梗死的治疗已有了长足的进步，但其仍是全球常见的致死性疾病，而心肌梗死面积是心肌梗死患者高病死率主要的决定因素。因此，限制心肌梗死面积成为了改善患者预后的重要治疗目标。目前，限制心肌梗死面积最有效的方法是早期对病变冠状动脉使用溶栓和介入进行再灌注治疗，以及抗血小板药物预防冠状动脉再次梗塞。而对于再灌注之后二次心肌损伤则成为改善心肌梗死患者预后的焦点。目前并无有效的药物应用于心肌缺血-再灌注损伤的保护。研究发现，心肌再灌注损伤与线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放具有密切联系。环孢霉素A(cyclosporin A，CsA)作为一种强效免疫抑制剂，其对MPTP的开放亦有很强的抑制作用而产生心肌保护效应。最近，在欧美国家已有小样本临床研究证实其效果，再灌注之前静注CsA的患者，其心肌梗死面积与对照组相比明显缩小。许多研究已发现CsA的心肌保护机制，但其具体机制仍未完全明确。

1 MPTP

心肌缺血-再灌注后通过MPTP的开放和心肌细胞过度收缩引起心肌细胞的死亡[1]。MPTP是线粒体内膜上的一种非特异性通道，虽然其分子结构尚未完全知晓，如外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel，VDAC)和内膜的腺嘌呤核苷酸转运体(adenine nucleotide translocator，ANT)尚存在争议，但可以肯定线粒体基质中的亲环素D(cyclophilin D，CypD)位于其中[2-3]。生理状态下，线粒体内膜对离子和代谢物质无通透性。在心肌缺血期间，MPTP仍处于关闭状态，而在长期缺血后再灌注时，由于基质的 Ca2+超载和活性氧的产生使得 MPTP开放。MPTP的开放于再灌注后迅速发生，这是一个动态和主动的过程，使得线粒体膜对小分子物质[分子量＜1.5 kD(≈1.5×103)]的通透性升高，导致线粒体膜电位去极化、呼吸链解偶联、激活细胞色素C、凋亡促进因子-1，而后激活caspases凋亡级联反应和其他凋亡因子。严重并长时的损伤导致了ATP耗竭，过多的水分进入线粒体基质致其肿胀而后破裂，出现caspase依赖与非依赖的级联反应使细胞死亡[4-5](图1)。因此，MPTP与心肌再灌注损伤的关系成为了心肌保护的重要关注点。

2 心肌保护与MPTP阻滞剂

目前心肌保护策略之一是使用药物维持线粒体膜的稳定性，例如MPTP阻滞剂CsA在许多动物心肌缺血-再灌注损伤实验(包括体外和在体实验)以及临床ST段抬高性心肌梗死患者的经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)的应用。在氧化应激的情况下，CsA于线粒体内膜和CypD结合抑制了MPTP的开放，从而维持了线粒体膜的稳定性，阻断细胞色素C的激活以及后续的凋亡级联反应过程，起到了保护心肌的作用(图1)。

2.1 CsA与心肌细胞容积调节有关

最新研究[6]发现，CsA的心肌保护作用不仅与阻滞MPTP有关，而且与心肌细胞容积的调节有关。在缺血预处理和后处理方面，MPTP于其中的关键作用人们已达成了共识。氯离子是细胞容积调节的关键阴离子，而缺血预处理通过激发氯离子外流增强了心肌细胞容积调节能力。缺血预处理时，通过阻断氯离子的跨膜转运阻止了细胞容积的调节，此时缺血预处理的保护作用也被阻断。因此，可以推测CsA的心肌保护作用机制与氯离子的跨膜转运产生细胞容积调节有关。实验以兔心脏做缺血-再灌注模型，CsA阻断MPTP后用茚基氧乙酸阻断氯离子通道，分别测定细胞损伤、细胞容积和胞内氯离子浓度，结果显示CsA的心肌保护作用受到显著抑制。

该实验未能明确说明CsA激活氯离子通道的机制，也没能验证其他离子(如钠、钙、钾离子)的跨膜转运对心肌细胞的影响，但此发现扩展了人们对CsA的心肌保护机制向其他更广泛的层面研究。

2.2 缓冲液与CsA均具有心肌保护作用

Duan等[7]发现，酸性缓冲液(pH 6.8)对心肌缺血-再灌注损伤亦有保护作用。结果显示酸性缓冲液与CsA均具有心肌保护作用，阻滞MPTP开放，抑制细胞色素C的释放，增加了Bcl-2的表达并降低了Bax的表达，从而减少了心肌细胞的凋亡。而Bcl-2和Bax在调节心肌凋亡过程中具有重要作用。Bax能直接产生线粒体外膜孔道或者与MPTP开放而提高线粒体通透性，而MPTP的开放又能刺激Bax的释放形成正反馈。而酸性缓冲液和CsA不仅能阻滞MPTP，还能干扰MPTP与Bax直接的反馈。同时，在病理生理状态下，抗凋亡蛋白Bcl-2能阻滞MPTP的开放。然而，该研究数据来源于体外动物实验，而缺血-再灌注能在血液中产生炎症因子，所以对于其临床应用仍需进一步的实验研究。

图1 缺血-再灌注后MPTP的分子模型与CsA的抑制作用

2.3 CsA的心肌保护作用与钙调磷酸酶无关

Leshnower等[8]于2008年验证了 CsA的心肌保护作用与钙调磷酸酶无关。CsA在与CypD反应时，除了能与CypD结合抑制MPTP的开放，同时还能与亲环素A结合产生抑制钙调磷酸酶的作用。钙调磷酸酶对体内钙调节的平衡起着重要的作用，并具有促凋亡和抗凋亡的双重性质。虽然关于CsA的心肌保护作用机制研究已有很多，但仍未清楚认识到其作用过程是仅通过抑制MPTP还是兼有钙调磷酸酶。

实验通过缺血-再灌注动物模型，分CsA组、钙调磷酸酶抑制剂(FK506)组和对照组，结果显示FK506组无明显病理损伤减轻，表明CsA的心肌保护作用与钙调磷酸酶无关。国内有研究[9]表明，CsA的心肌保护作用不仅是通过阻滞MPTP的开放。因CsA的MPTP阻滞作用可被5-羟基葵酸盐(5-HD)取消，实验分设缺血-再灌注组、CsA组、CsA+5-HD组，结果显示CsA组和CsA+5-HD组较缺血-再灌注组CD4+T细胞表达明显减少，病理损伤程度减轻，表明CsA被取消作为MPTP抑制剂作用后仍能产生心肌保护作用，其机制可能与抑制CD4+T细胞的激活有关。该实验提出了CsA不同的机制途径，扩展了研究思路，但仍未明确T细胞是如何被激活以及具体的心肌保护机制。

3 CsA的动物实验

3.1 有明显的心肌保护作用

许多动物实验(包括鼠、猪、兔)验证了CsA的心肌保护作用。早在2007年就有一项在体动物实验证明CsA具有明显的心肌保护作用[10]。该实验将SD雄性大鼠阻断冠状动脉前降支30 min后复灌180 min，分别于阻断冠状动脉前10 min对实验组与对照组静脉注射CsA与生理盐水，结果显示实验组心肌梗死面积明显小于对照组。Skyschally等[11]为了减小种属差异性，以猪为实验对象，在复灌前5 min静脉注射CsA，同时增加了缺血后处理组(20 s再次梗塞与复灌6个周期)，同样验证了CsA和缺血后处理均具有心肌保护作用。Pritzwald-Stegmann等[12]2011年的一项体外动物实验表明于组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液(HTK液)加入低剂量CsA(1 μmol/L)能够明显增强心肌收缩力、减少耗氧量。该心肌保护作用模拟了心脏手术，为心脏手术时心肌能够耐受更长时的缺血期提出了新方法。Huhn等[13]在肥胖大鼠上做CsA的心肌保护实验，发现肥胖大鼠的心肌梗死面积与对照组无差别，且血糖、胆固醇、三酰甘油均明显升高，表明在糖尿病前期，CsA的心肌保护作用受到明显抑制。

3.2 CsA的其他作用

Huang等[14]发现CsA能提高心脏骤停大鼠的生存率和心脏功能。建立大鼠窒息后心脏骤停模型，CsA于开始复苏时和复苏后循环恢复3 min分别使用，前者左室收缩、舒张功能和心排血量、72 h生存率均显著高于后者，延迟使用CsA组心肌细胞电镜下线粒体的完整性和功能均差于复苏开始时使用组。虽然该实验仍需进一步的临床证据，但是该结果拓展了临床心脏骤停患者治疗的新思路。Dhandapany等[15]研究发现CsA能抑制心肌肥大。心肌肥大与钙调磷酸酶的信号转导有关。而CsA对钙调磷酸酶的阻滞作用抑制了RAF1的过度表达，后者能引起肥厚型心肌病发病率增高。该研究可能为RAF1突变引起的心肌肥大提供新的治疗靶点。Troitzsch等[16]建立家兔骨骼肌(背阔肌)缺血-再灌注模型，实验组和对照组于缺血发生前10 min分别注射CsA和生理盐水，实验组组织氧分压、高能磷酸键水平、线粒体功能均明显优于对照组，表明CsA对骨骼肌亦有很好的保护作用。该实验为CsA对其他非心肌组织的保护性应用提供了广泛的研究思路和很好的临床前景。

4 CsA的临床试验

Piot等[17]在2008年《新英格兰杂志》上发表了一篇关于CsA心肌保护作用的临床试验。试验募集了58名急性心肌梗死患者作为志愿者，以心肌缺血时间、缺血面积、射血分数等为依据进行分组消减异质性。试验分为CsA组与对照组，在行PCI前分别静脉注射CsA与生理盐水，结果显示CsA组心肌梗死面积明显减少。该试验很好地验证了CsA对人类心肌梗死后再灌注具有心肌保护作用，但由于样本量的限制，仍需进一步的大样本临床试验进行验证。Ghaffari等[18]在一项类似的临床试验中获得了不同的结果。以101名急性ST段抬高性心肌梗死患者作为实验对象，试验方法与之前基本相同，不同点在于Ghaffari是以溶栓作为再灌注的治疗方法而非 PCI，结果显示CsA不能减少心肌梗死面积和改善预后。

该次试验由于样本量相对较小，可能限制了CsA作用的表现，其次，CsA的使用时相与剂量也未达到最佳效果。另外，试验只是通过生化指标判断，并未进行核磁共振成像评价心肌梗死面积(仅通过心肌酶谱推断心肌梗死面积)。Mewton等[19]以相同的试验方法对28名心肌梗死患者施行分组并验证了CsA的作用，同时随访6个月观察CsA心肌功能及心肌重塑的影响。结果显示实验组左室收缩末期容积、心肌梗死面积均小于对照组，左室射血分数改善，两组左室质量、远距未发生心肌梗死的心肌区域室壁厚度无差异性，表明CsA不仅对心肌重塑无不良作用，而且对心肌梗死面积有持续的良性作用。同样，由于临床实验的约束性，该实验样本量偏少以至削减了其可信度，但可喜的结果值得人们进一步深入研究乃至实践应用。

5 关于心肌保护在动物实验与临床试验的比较

许多动物实验已经证明CsA的心肌保护作用，而其中大部分实验是以啮齿动物为实验对象，以致不能直接应用于人类疾病。虽然已有一些小样本临床实验得到了验证，但仍缺少大规模的临床试验加以检验。同时，不得不承认有许多潜在因素可能暗示着其临床应用的缺陷，包括[20]:(1)动物实验时通常使用在严格控制的环境下统一饮食标准并筛选同性别的年轻健康动物为实验对象，而人类有着不同的种族、地域环境、遗传特异性等变化因素。(2)人的急性心肌梗死虽是急性发病，但却有一个漫长的病变过程，而动物实验的心肌梗死模型心肌缺血时间明显较短，以致于其心肌更容易获得挽救。(3)心肌梗死患者普遍年龄较大，同时伴有诸多合并症，而动物实验通常以年轻、无合并症的动物为对象。(4)实验前，动物均未接触过任何药物，而患者一般均服用过药物，这可能对缺血-再灌注损伤产生影响。(5)动物实验可能不会涉及到药物对心脏以外的其他器官的影响，而临床实验时药物可能会对其他器官产生不良影响以致其在临床的应用受限。(6)在我国，CsA的临床实验也受到了伦理道德的制约，以致其在亚裔人种中的疗效不能得到验证与体现。

动物实验的差异性和临床实验的限制性制约了CsA的临床应用，而CsA心肌保护作用的价值绝不会因此而被放弃，人们可以通过进一步的动物实验减少物种差异性和干扰因素，并努力从小样本开始逐步开展临床试验，为CsA的临床应用增加更多的可信度与可行性。

6 关于CsA的不良反应

CsA的不良反应同样应予以重视。作为免疫抑制剂，在移植患者中使用CsA，随着用药时间和剂量的积累，其不良反应发生率逐渐升高，包括有肾毒性、多毛症、手脚麻痹、震颤、胃肠不适、牙龈增生、可逆性肝损害等。幸运的是，在临床试验中[17-19]，CsA单次给药均未发现不良反应。虽然如此，我们仍不可忽视CsA在保护心肌应用中可能存在的负面效应。

7 展望

CsA不仅通过与线粒体内膜的CypD结合抑制MPTP的开放，酸性环境(pH 6.8)也可抑制MPTP的开放，抑制细胞色素C，增加Bcl-2表达，从而阻断了后续心肌细胞的凋亡过程;另外，CsA的保护机制还可能与氯离子的外流和抑制CD4+T细胞的激活有关。许多动物实验和一些小样本的临床试验已经验证了CsA在缺血-再灌注时的心肌保护作用。另外，Huhn等[13]发现肥胖大鼠的CsA心肌保护作用受到抑制，虽然该结论有待进一步的实验证明，但CsA在心肌梗死伴有糖尿病患者的应用可能受到削弱甚至无效，由于心肌梗死患者常常伴发糖尿病，因此，对这方面的研究应加以重视和深入。CsA对骨骼肌也具有缺血-再灌注损伤的保护作用，用于心脏骤停时也可改善心脏功能和生存率，CsA还能通过钙调磷酸酶的阻滞抑制RAF1的过度表达降低肥厚型心肌病的发病率。小样本的临床试验中，使用PCI作为再灌注手段时，CsA起到了保护作用，而溶栓治疗则无效。物种差异性和伦理方面的限制性约束了CsA的临床应用。虽然动物实验的缺陷，如动物的严格一致性与人类的多样性，缺血-再灌注的短时间模拟与心肌梗死长时间的病变过程、并发症、不良反应和用药史等方面诸多因素的限制，而CsA的应用价值不会因此被放弃，进一步的研究可为其临床应用增加可行性。虽然CsA作为免疫抑制剂在长时间应用具有很大的毒副作用，而在单次给药时并未发现负面效应。因此，CsA在心肌梗死患者的临床应用可能为临床提供更有效的治疗选择。

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