靶向肿瘤腺病毒介导IL-24抑制人胃癌细胞增殖

曹亚玲，黄茂涛，黄 一，季代金，冯早明，李学成，陈 陵

靶向肿瘤腺病毒介导IL-24抑制人胃癌细胞增殖

曹亚玲，黄茂涛，黄 一，季代金，冯早明，李学成，陈 陵

目的 探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子特异驱动IL-24的重组腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)对人胃癌SGC-7901细胞增殖及侵袭能力的影响。方法 将Ad-phTERT-IL-24感染人胃癌SGC-7901细胞，采用荧光实时定量PCR及Western blot检测IL-24表达；采用CCK-8方法检测细胞生长曲线；采用Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果 与以PBS代替病毒液处理的SGC-7901细胞相比，感染Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901细胞内IL-24 表达明显升高(P<0.01)，于第5、6 d吸光度明显下降(P<0.05)，细胞侵袭能力亦显著降低(P<0.05)。结论 Ad-phTERT-IL-24可有效上调人胃癌SGC-7901细胞IL-24表达，进而抑制细胞增殖及侵袭能力。

端粒酶；逆转录酶；启动子；腺病毒；白细胞介素-24；胃癌

胃癌是发病率、致死率最高的肿瘤之一，多数患者确诊时已是晚期，传统手术、化疗及放疗疗效欠佳[1]，亟需深入研究胃癌发病机制并开发新的治疗模式[2]。IL-24是近年新发现的抑癌基因，具有多重抗肿瘤作用[3]。本课题在前期实验中成功构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子特异驱动IL-24的复制缺陷型腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)，本研究拟进一步采用Ad-phTERT-IL-24介导胃癌细胞内IL-24过表达，探讨IL-24对肿瘤细胞增殖及侵袭能力的影响，为进一步研究基于hTERT启动子与IL-24的肿瘤靶向基因治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人胃癌SGC-7901细胞株(中科院上海生科院细胞资源中心)，RPMI 1640培养液、胎牛血清及胰蛋白酶(美国HyClone公司)；hTERT启动子特异驱动人IL-24的复制缺陷型腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)，由本室构建并保存；负载有β-半乳糖苷酶(β-gal)基因LacZ 的复制缺陷型腺病毒，由西南医院心内科唐兵博士惠赠。Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，RT逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(日本TAKARA公司)；CCK-8检测试剂盒(碧云天)；胶原包被Transwell板(美国Corning公司)；M-PERTM蛋白提取试剂(美国Pierce公司)；小鼠抗人IL-24单克隆抗体、HRP标记兔抗小鼠二抗(英国Abcam公司)；ECL化学发光反应液(美国Thermo公司)；IL-24 PCR引物由上海生工合成纯化，其上游序列P1：5'- CAGGAGGAACACGAGACTGA-3'；下游序列P2：5'- GCACAACCATCTGCATTTGAGA-3'，扩增片段长度120 bp[4]；内参U6特异RT及real-time PCR引物套装购自广州锐博公司[5]；ABI 7500荧光定量PCR仪(美国AB公司)；Nanodrop ND-1000紫外分光光度计(美国Thermo公司)。

1.2 Ad-phTERT-IL-24感染人胃癌细胞SGC-7901 采用含10%标准胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养SGC-7901细胞。取对数生长期的SGC-7901细胞接种于6孔细胞培养板中，感染Ad-phTERT-IL-24病毒液。设空白对照组(加入PBS)和阴性对照组(Ad-LacZ)，腺病毒感染步骤参照文献[6]进行。

1.3 RT-qPCR检测IL-24的表达 取1.2步骤所得107个细胞，以200 g离心5 min，弃上清后加Trizol试剂1 ml，反复吹打。按照Trizol试剂说明书步骤提取总RNA，再将总RNA溶于DEPC水中，测定RNA浓度和纯度。以U6管家基因做为内参，设3个复孔。取总RNA 100 ng为模板，按照RT逆转录试剂盒说明书配20 μl反应体系，反应条件为42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；然后按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书，取4 μl cDNA为模板，配25 μl反应体系，预变性95 ℃ 30 s，反应40个循环，条件为95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s。采用2-△△Ct法进行结果分析，将不同标本的RQ值(RQ=2-△△Ct)进行比较。△Ct=目的基因Ct值-内参照基因Ct值，△△Ct=待测标本的△Ct-校正器△Ct。

1.4 Western blot检测细胞内IL-24的表达 按M-PERTM试剂盒说明书提取细胞总蛋白，SDS-PAGE 10%凝胶电泳，使用80 V进胶，140 V电泳至溴酚蓝距下缘1 cm处终止。转PVDF膜，5%脱脂牛奶4 ℃封闭过夜。IL-24蛋白一抗以1∶200稀释，室温下孵育2 h。以1∶2000稀释二抗，室温下孵育2 h。加入ECL化学发光反应液，室温1 min后成像，采用Image J软件进行定量分析。

1.5 CCK-8方法检测细胞增殖 待检测细胞以每孔2.5×103个细胞接种于96孔板，每天检测1次，共6 d，设5个复孔。检测前每孔加入20 μl CCK-8，避光37 ℃孵育2 h，酶标仪测定450 nm波长处吸光度(D)值。观察IL-24对胃癌细胞增殖的影响并计算抑瘤率。抑瘤率=(1-T/C)×100%。

1.6 Transwell小室检测胃癌细胞侵袭能力 感染腺病毒72 h后，收集细胞以无血清RPMI 1640培养液稀释为1×105个/ml的细胞悬液，每孔加入200 μl于Transwell上室，下室加入800 μl含10%血清的DMEM培养液，37 ℃孵育24 h后，酒精棉球拭去上室细胞，以95%酒精固定后，1%结晶紫染色3 min。采用显微镜观察细胞侵袭情况，每组设5复孔。结果统计：随机取5个200倍视野，计数细胞后取平均值。

2 结果

2.1 RT-qPCR检测各组细胞IL-24的表达 与PBS空白对照组比较，感染Ad-phTERT-IL-24后，SGC-7901细胞内IL-24 mRNA表达丰度显著上调(2.95±0.42 vs.0.93±0.07,P<0.01)；而Ad-LacZ感染SGC-7901细胞后，细胞内IL-24 mRNA表达无明显改变(1.18±0.17 vs.0.93±0.07,P>0.05)。

图1 Western blot检测各组细胞内IL-24的表达

2.2 Western blot检测各组细胞内IL-24的表达 采用Ad-phTERT-IL-24感染hTERT阳性的人胃腺癌SGC-7901细胞后，借助Image J软件进行定量分析可见，与PBS空白对照组相比，Ad-phTERT-IL-24组IL-24表达显著上调(0.36±0.05 vs.0.06±0.02，P<0.01)，而Ad-Lac组则与PBS组近似(0.10±0.02 vs.0.06±0.02，P>0.05)，见图1。

2.3 Ad-phTERT-IL-24抑制SGC-7901细胞增殖 将Ad-phTERT-IL-24及阴性对照Ad-Laz感染SGC-7901细胞24 h后，采用CCK-8检测细胞生长曲线(图2)。结果表明，与PBS空白对照组相比，感染了Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901实验组细胞增殖受到明显抑制。在第5、6 d，实验组吸光度显著减少(P<0.05)，而Ad-LacZ组与PBS组无显著差异。Ad-phTERT-IL-24组第5、6 d抑瘤率分别为37.8%、36.5%。

图2 CCK-8方法检测各组SGC-7901细胞生长曲线与PBS组比较，①P<0.05

2.4 Ad-phTERT-IL-24抑制SGC-7901细胞侵袭能力 为进一步检测Ad-phTERT-IL-24是否影响SGC-7901胃癌细胞的侵袭能力，采用Transwell侵袭实验检测了SGC-7901经重组腺病毒Ad-phTERT-IL-24感染后的侵袭能力。与对照组相比，Ad-phTERT-IL-24实验组细胞侵袭能力显著下降(17.80±7.40 vs.34.20±7.22，P<0.05)，而Ad-LacZ组与PBS组无差著差异(37.80±12.09 vs.34.20±7.22，P>0.05)。

3 讨论

已有文献报道IL-24是一个抑瘤基因，对多种肿瘤有抑制作用，包括肺癌[7]、骨肉瘤细胞[8]、胶质瘤[9]、肝癌[10]和胃癌等[11]。IL-24发挥抑瘤作用的机制，包括抑制增殖、诱导凋亡，增加肿瘤细胞对化疗的敏感性，抑制肿瘤转移等[12]。肿瘤的基因治疗一方面需要选择强效广谱的治疗基因，另一方面要尽量选择具有肿瘤靶向性的载体[13]。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)在几乎所有胃癌组织中强阳性表达，而在正常组织中不表达或低表达[14]。以hTERT启动子特异驱动治疗基因是实现肿瘤靶向基因治疗的较佳策略[15]。目前利用hTERT启动子靶向肿瘤表达IL-24的重组腺病毒对胃癌的作用尚不明确。本研究采用在前期实验中成功包装的hTERT启动子特异驱动IL-24重组腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)，感染hTERT阳性的人胃腺癌SGC-7901细胞株，发现与PBS空白对照组相比，Ad-phTERT-IL-24可显著上调SGC-7901细胞内IL-24的表达水平(P<0.01)，无论是在mRNA水平还是蛋白水平，负载LacZ的腺病毒(Ad-LacZ)均与PBS组近似(P>0.05)，表明Ad-phTERT-IL-24上调SGC-7901细胞IL-24的表达，是由于其携带的靶基因IL-24所致，而非腺病毒感染引起。

进一步采用CCK8方法检测IL-24对SGC-7901细胞的增殖情况，发现与PBS组相比，感染Ad-phTERT-IL-24后，SGC-7901细胞增殖能力在第1～4 d抑制不明显，但第5、6 d受到明显抑制；而感染Ad-LacZ组始终与PBS组无明显差异。表明采用Ad-phTERT-IL-24上调SGC-7901细胞内IL-24表达水平，即可明显抑制SGC-7901细胞增殖能力。在第1～4 d时，SGC-7901细胞未受到抑制，可能是因为腺病毒感染后，从DNA转录IL-24 mRNA进而翻译IL-24蛋白，需要2～4 d的时间，并且，也需要IL-24表达达到一定强度才能发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。为进一步观察IL-24对SGC-7901胃癌细胞侵袭能力的影响，本课题进行了Transwell小室侵袭实验。结果发现，感染Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901细胞的侵袭能力只有PBS组的一半(P<0.05)，而Ad-LacZ组与PBS组无显著差异(P>0.05)。表明具有肿瘤靶向性同时负载IL-24的重组腺病毒Ad-phTERT-IL-24，可显著抑制胃癌细胞的增殖及侵袭能力，在胃癌的基因靶向治疗中具有潜在应用价值。

[1] Shi Y,Zhou Y.The role of surgery in the treatment of gastric cancer[J].J Surg Oncol,2010,101(8):687-692.

[2] Saif MW,Makrilia N,Zalonis A,et al.Gastric cancer in the elderly:an overview[J].Eur J Surg Oncol,2010,36(8):709-717.

[3] Lebedeva IV,Su ZZ,Vozhilla N,et al.Mechanism of in vitro pancreatic cancer cell growth inhibition by melanoma differentiation-associated gene-7/interleukin-24 and perillyl alcohol[J].Cancer Res,2008,68(18):7439-7447.

[4] Kreis S,Philippidou D,Margue C,et al.Recombinant interleukin-24 lacks apoptosis-inducing properties in melanoma cells[J].PLOS ONE,2007,2(12):e1300.

[5] 陈陵,李学成,李向红,等.miR-29在胃癌中的表达及其临床意义[J].临床肿瘤学杂志,2011,16(04):315-317.

[6] 熊晓峰,陈陵,范亚川,等.负载hTERT调控相关miR-138复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定[J].重庆医学,2011,40(9):896-898.

[7] 朱晔涵,杜贤荣,陈华昕,等.Ad-ING4-IL-24双基因共表达对人肺腺癌化疗的增敏效应[J].生物工程学报,2011,27(1):85-94.

[8] 韩亚丽,缪竞诚,盛伟华,等.Ad-IL-24对MG-63人骨肉瘤细胞抑癌效应的体内外实验[J].生物工程学报,2009,25(10):1538-1545.

[9] Hamed HA,Yacoub A,Park MA,et al.Histone deacetylase inhibitors interact with melanoma differentiation associated-7/interleukin-24 to kill primary human glioblastoma cells[J].Mol Pharmacol,2013,84(2):171-181.

[10] 张翔,孟艳玲,王磊,等.MDA-7/IL-24真核表达载体的构建和重组腺病毒的制备及其对肝癌细胞生长抑制作用的研究[J].细胞与分子免疫学杂志,2011,27(12):1277-1279.

[11] 包婉蓉,缪竞诚,盛伟华,等.Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞生长抑制的体外实验[J].生物工程学报,2009,25(10):1586-1592.

[12] Maarof G,Bouchet-Delbos L,Gary-Gouy H,et al.Interleukin-24 inhibits the plasma cell differentiation program in human germinal center B cells[J].Blood,2010,115(9):1718-1726.

[13] Xu Y,Hou J,Liu Z,et al.Gene therapy with tumor-specific promoter mediated suicide gene plus IL-12 gene enhanced tumor inhibition and prolonged host survival in a murine model of Lewis lung carcinoma[J].J Transl Med,2011,9:39.

[14] 陈陵,梁光萍,汤旭东,等.端粒酶活性调控研究进展[J].实用临床医药杂志,2010,14(5):25-31.

[15] 余松涛,杨应斌,史春梦,等.端粒酶hTERT亚单位启动子靶向性慢病毒对肿瘤活体实时显像的实验研究[J].实用临床医药杂志,2010(5):4-12.

Suppression of gastric cancer cell growth by tumor-targeted adenovirus mediated IL-24 gene

Cao Yaling1,Huang Maotao1,Huang Yi2,Ji Daijin1,Feng Zaoming1,Li Xuecheng3,Chen Ling2

1.Department of Digestion,Hospital 452 of PLA,Chengdu,Sichuan,610021,China;2.Department of Digestion,Hospital 324 of PLA,Chongqing,400020,China;3.Emei Sanatorium of Chengdu Military Command,Emeishan City,Sichuan,614200,China

Objective To discuss the effects of human telomerase reverse transcriptase(hTERT)promoter targeted recombinant adenoviral vector carrying human IL-24 gene(Ad-phTERT-IL-24)on the proliferation and infestation ability of SGC-7901 human gastric cancer cells.Methods SGC-7901 tumor cells were infected by Ad-phTERT-IL-24.IL-24 expression level was examined by RT-qPCR and Western blot.CCK8 assay was used to detect the cell growth curve.Transwell camber infestation experiment was carried out to evaluate the invasion capability of SGC-7901 tumor cells.Results The expression of IL-24 in the SGC-7901 cells infected with Ad-phTERT-IL-24 significantly increased compared with the cells treated with PBS instead of virus liquid(P<0.01),the absorbance decreased significantly since the fifth and sixth day(P<0.05).Meanwhile the invasion ability also decreased significantly(P<0.05).Conclusion Ad-phTERT-IL-24 can effectively up-regulate the IL-24 expression and furthermore suppress the proliferation and invasion ability of human SGC-7901 gastric cancer cells.

telomerase;reverse transcriptase;promoter;adenovirus;IL-24;gastric cancer

国家自然科学基金资助课题(30900679)；重庆市集成示范计划项目(cstc2013jcsf10014)；重庆市医学科研计划项目(2011-2-587)；四川省卫生厅科研课题(110484)

610021 成都，解放军452医院消化内科(曹亚玲，黄茂涛，季代金，冯早明)；解放军324医院消化内科(黄 一，陈 陵)；成都军区峨眉疗养院(李学成)

陈 陵，E-mail:lingcong_008@126.com

R 739

A

1004-0188(2014)01-0009-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.004

2013-10-21)