2型糖尿病兼抑郁症大鼠模型的建立与评价

李娜，刘群，李晓娟，白晓晖，刘玥芸，金钟晔，景玉霞，2，赵宏波，3，陈家旭

(1.北京中医药大学基础医学院，北京 100029;2.新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐 830054;3.北京市石景山区中医医院，北京 100043)

糖尿病并发抑郁症是在糖尿病的基础上出现抑郁症状，糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱，持续高血糖并伴情绪障碍，以心境低落为主，严重者有自杀倾向［1］。转引自世界卫生组织1993年以来开展全球疾病负担研究发现的一段资料表明，糖尿病患者的抑郁症患病率为21.8% ～60.8%［2］，并有国外资料报道，糖尿病患者抑郁症患病率至少是普通人群的3倍，其中中重度抑郁占1/3［3］。现今生理-心理-社会医学模式已被广大医学工作者所接受，但糖尿病合并抑郁症的具体作用机制众说纷纭。用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱发糖尿病模型已有 50 年的历史［4］［5］，本课题组采用的21 d慢性束缚建立抑郁症模型也有良好稳定的实验基础［6］。因此本课题组采用高脂饲料喂养加腹腔注射小剂量STZ的方法制备2型糖尿病模型，并在其基础上再用21 d慢性束缚应激抑郁的方法建立糖尿病兼抑郁症大鼠模型。并从大鼠的宏观表征、空腹血糖、体重、旷场实验行为学角度评价此模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠38只，雄性，4周龄，体重(170±20)g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2012-0001】。实验在北京中医药大学屏障环境动物实验室进行【SYXK(京)2011-0024】。

1.1.2 仪器

STZ:Sigma公司(美国)。一水合柠檬酸:西陇化工股份有限公司(中国)。二水合柠檬酸三钠:国药集团化学试剂有限公司(中国)。强生稳豪型血糖仪及配套试纸(美国)。大鼠束缚架:自制，木质结构，上面两侧分别有两条可以调节的粘贴软带，分别用来束缚大鼠的胸部和腹部(中国)。大鼠旷场行为测试箱:自制，木质(长×宽×高为100 cm×100 cm×40 cm)，底面由黄色线条划分成面积相等的25个方格(中国)。计算机 WV-CP470摄像头(Panasonic)(日本)。The Observer.5.0分析软件(Noldus，Netherlands)，EthoVision 3.0 分析软件(Noldus，Netherlands)进行分析(荷兰)。

1.1.3 饲料

基础饲料由北京中医药大学动物中心提供;高脂饲料购自北京华阜康公司(配方:68.8%基础饲料、10%蔗糖、10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇、0.2%胆盐)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

38只大鼠适应性喂养1周后，按体重随机分为两组，其中8只为正常组，饲以普通饲料，其余30只大鼠饲以高脂饲料。所有大鼠均由SPF级饲养，每天12 h光照维持，昼夜循环，自由饮水进食。6周后，夜间禁食14 h后，高脂饲料组腹腔注射STZ(35 mg/kg溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液，pH 4.4)于3 d后及7 d后测空腹血糖，测得两次血糖值＞11.1 mmol/L者为2型糖尿病造模成功。选取造模成功的19只大鼠，按血糖高低编号，用Excel表进行随机分组，分为2型糖尿病模型组(T组)，2型糖尿病兼抑郁症模型组(T+D组)。

1.2.2 2型糖尿病模型成功后慢性束缚应激模型的建立

2型糖尿病兼抑郁症造模参考［7～10］，并进行改良，采用本课题组长期稳定的慢性束缚应激抑郁模型［11］，即将2型糖尿病大鼠捆绑在自制的束缚架上造模，随机选取时间进行束缚，3 h/d，连续21 d。正常组及2型糖尿病组不予束缚，但在相同的时间内禁食水。

1.2.3 观测指标与方法

(1)一般状态的观察

包括毛发，精神状态，情绪反应，大便，四肢耳廓皮肤黏膜，对束缚的反应。

(2)体重及空腹血糖监测

于慢性束缚期间的第0、7、14、21天进行体重和空腹血糖的监测。

(3)旷场实验

在安静、遮光的环境下进行。将大鼠放入箱内底面中心，利用同步录像、计时，观察5 min内大鼠在旷场行为测试箱内的活动情况。每只大鼠检测完毕后用70%乙醇清洗方箱内壁及底面，以免上次大鼠余留的信息(如大鼠的大、小便、气味)影响下次测试结果。更换大鼠，继续实验。观察指标如下:①总移动距离:5 min内大鼠运动轨迹的总长度;②移动速度:5 min内大鼠运动轨迹的速度。

1.2.4 统计学方法

运用SPSS 17.0软件，采用单因素方差分析及t检验进行统计，数据以(±s)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

慢性束缚期间，3只大鼠死亡，总共剩余24只大鼠。

2.1 宏观表征

N组大鼠，皮毛顺滑有光泽，精神状态良好。T组大鼠，精神尚可，毛色发黄，体重增长缓慢，粪便、尿量增多，进食量、饮水量增多。T+D组大鼠，造模初期焦躁，反抗力强，后期毛发散乱，无光泽，反抗力减弱，活动迟缓、扎堆、反应迟钝，精神萎靡，皮肤及黏膜颜色变浅、皮毛变黄、清洁度明显减低，大便时干时稀甚至稀溏，进食量、饮水量增加，粪便尿量增加。

2.2 体重变化

给予高脂饲料及腹腔注射STZ制备2型糖尿病模型后，T组和T+D组在0、7、14、21 d各组大鼠体重均下降，与N组比较差异有显著性(P＜0.05;P＜0.01)，21天慢性束缚刺激后，大鼠体重下降，T+D组体重比T组大鼠体重增加缓慢，差异有显著性(P＜0.05)。见表1。

2.3 空腹血糖变化

给予高脂饲料及腹腔注射STZ制备2型糖尿病模型后，T组和T+D 组在0、7、14、21天各组大鼠血糖均升高，与N组比较差异有显著性(P＜0.01)，21天慢性束缚刺激后，第21天T+D组大鼠空腹血糖比T组较高，两组间差异有显著性(P＜0.01)。

2.4 旷场实验

21d慢性束缚造模后，大鼠5 min内总移动距离有变化，与 N组相比，T组差异无显著性(P＞0.05)，T+D组差异有显著性(P＜0.05)，但与T组相比，T+D组差异无显著性(P＞0.05);大鼠5 min内移动速度有变化，与N组相比，T组差异有显著性(P＜0.05)，T+D组差异有显著性(P＜0.01)，但与T组相比，T+D组差异无显著性(P＞0.05)。

表1 各组大鼠体重变化情况(g，±s，n=8)Tab.1 Body weight of the rats in each group

表1 各组大鼠体重变化情况(g，±s，n=8)Tab.1 Body weight of the rats in each group

注:与 N组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与 T组相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with the group N，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the group T，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

组别Groups第0天Day 0第7天Day 7第14天Day 14第21天Day 21 N组 402.475±8.997 427.063±10.425 435.238±10.501 451.213±11.115 T组 357.125±12.594# 367.988±12.393## 374.525±11.813## 385.363±12.149##T+D组 349.200±11.947## 337.763±11.348## 338.234±12.791## 345.800±10.817##*

表2 各组大鼠空腹血糖变化情况(mmol/L，±s，n=8)Tab.2 Fasting blood glucose of rats in each group

表2 各组大鼠空腹血糖变化情况(mmol/L，±s，n=8)Tab.2 Fasting blood glucose of rats in each group

注:与 N组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与 T组相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with the group N，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the group T，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

组别Groups第0天Day 0第7天Day 7第14天Day 14第21天Day 21 N组 4.562±0.174 4.075±0.385 4.388±0.506 4.562±0.096 T组 20.075±1.268## 20.625±0.623## 21.975±0.995## 20.700±1.034##T+D组 22.375±4.579## 21.800±3.746## 23.000±3.000## 24.475±0.903##＊＊

表3 旷场实验大鼠5 min内总移动距离、运动速度(cm，cm/s，±s，n=8)Tab.3 Total movement distance(cm)and movement speed in 5 minutes of open field test

表3 旷场实验大鼠5 min内总移动距离、运动速度(cm，cm/s，±s，n=8)Tab.3 Total movement distance(cm)and movement speed in 5 minutes of open field test

注:与 N组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与 T组相比，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。Note:Compared with the group N，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the group T，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

组别Groups总移动距离/cm Movement distance移动速度/cm/s Movement speed N组 1532.604±126.805 5.114±0.423 T组 1304.333±201.770 2.943±0.609#T+D组 940.533±208.296# 2.429±0.508##

3 讨论

根据临床研究发现，在糖尿病人群中，抑郁症的发生与女性20～40岁、病程较长、体重指数 ＞25 kg/m2、糖化血红蛋白＞8%、无配偶支持或婚姻不完整、经济状况不好、从事体力劳动、并发症数目较多、慢性并发症增加密切相关，其中中重度抑郁占1/3［12］。糖尿病是慢性疾病，可引起全身多器官的病变。患者体重下降、形体消瘦，因血糖控制不稳定，多脏器同时功能降低，加重患者的心理负担，严重者则抑郁，而抑郁的患者体内某些神经递质改变，又会加重血糖的升高，情绪更加低落，降低治疗的依从性，从而导致恶性循环。因此开发治疗糖尿病兼抑郁症的药物是最迫切的项目之一，而要找到起效快、毒性小的药物，动物模型的应用必不可少。动物模型是药物研发和机制研究中不可或缺的环节，对于评价药物的有效性和安全性起着重要的作用，而合理的动物模型的建立和评价，能缩短动物模型和临床疾病的特征差异，使之与临床吻合度增高［13］。本研究综合运用高脂饲料喂养加腹腔注射STZ，并在其基础上采用21天慢性束缚的方法造成大鼠的抑郁状态，从而建立2型糖尿病兼抑郁症大鼠模型。此实验中，2型糖尿病兼抑郁症模型大鼠，造模初期焦躁，反抗力强，后期毛发散乱，无光泽，反抗力减弱，活动迟缓，反应迟钝，精神萎靡，进食量、饮水量增加，粪便尿量增加，体重减轻。2型糖尿病兼抑郁症模型大鼠较之2型糖尿病模型大鼠，在糖尿病形成的初期，即慢性束缚第0天，体重与空腹血糖没有统计学差异，在21天慢性束缚期间，2型糖尿病兼抑郁症模型大鼠的体重增长缓慢，空腹血糖升高，在第21天，2型糖尿病组大鼠和2型糖尿病兼抑郁症组的体重和空腹血糖有差异，在旷场实验中运动距离和运动速度都下降，而旷场实验是评定大鼠在新异环境中的启动、探究行为和对新环境的警觉性。总移动距离和移动速度初步评价大鼠的自发活动度，2型糖尿病兼抑郁症模型大鼠的总移动距离明显小于正常大鼠和糖尿病大鼠，表明2型糖尿病兼抑郁症模型大鼠的自发活动度减小［14］，说明21天慢性束缚应激抑郁模型的建立成功。这同临床上糖尿病兼抑郁症患者不思饮食，体重下降，兴趣丧失，精神运动改变、情绪低落，活动减少，血糖监控较差，治疗依从性低，在一定程度上有一致性，因此提示成功复制2型糖尿病兼抑郁证大鼠模型，有利于后续的实验研究。

［1］Robertson MM，Katona CLE.Depression and Physical Illness［M］.John Wiley＆ Sons Ltd，1997:257-260.

［2］刘增垣，何裕民.心身医学［M］，上海:上海科技教育出版社，2000:3.

［3］Padett DK.Sociodemographic and disease related correlates of depressive morbidity among diabetic patients in Zagreb，Croatia［J］.J New Nerv.Ment Dis，1993，181(3):280.

［4］Rakieten N，Rakieten ML，Nadkarni MV.Studies on diabetogenic action of streptozotocin(NSC-367917)［J］.Cancer Chem Ther Rep，1963，29:91-941.

［5］穆松牛，高云，万福生，等.链尿佐菌素加高糖高脂饮食复制大鼠2型糖尿病模型［J］.中国比较医学杂志，2008，18(2):19-22.

［6］岳利峰，丁杰，陈家旭，等.肝郁脾虚证大鼠模型的建立与评价［J］.北京中医药大学学报，2008，31(6):396-400.

［7］王晓敏，谢斌，周志愉，等.丹栀逍遥散对糖尿病抑郁大鼠胰岛素受体和胰岛素底物-1 mRNA表达的影响［J］.中国老年学杂志，2011，4(7):1181-1183.

［8］王晓敏，罗颖，高增光.丹栀逍遥散对糖尿病抑郁大鼠肝组织IRS2-PI3K信号通路的作用［J］.中华中医药学刊，2013，31(11):2450-2452.

［9］朱艳芳，徐志伟.加减逍遥散影响慢性心理应激T2DM小鼠IR机制的研究［D］.广东中医药大学2013年博士学位论文

［10］李杰，刘艳民，李庆和，等.心理应激诱发实验性2型糖尿病大鼠的行为学改变及中药干预［J］.天津中医药，2008，20(4):72-74.

［11］李伟，陈家旭，杨建新，等.疏肝健脾补肾复方对慢性束缚应激大鼠行为学和免疫功能的影响［J］.中国实验动物学报，2003，11(1):33-37.

［12］赵毛红，付阿丹.糖尿病人群伴发抑郁症的临床研究［J］.中国糖尿病杂志，2002，10(5):272-275.

［13］白晓宇，杜冠华.抑郁症动物模型的转换研究［J］.中国比较医学杂志，2011，21(10，11):121-126.

［14］李腾飞，孙秀萍，石哲，等.不同品系小鼠在三种常见抑郁检测方法中的行为学表现［J］.中国比较医学杂志，2011，21(8):20-23.