无血清培养的脐带间充质干细胞治疗乙型肝炎肝硬化的临床观察

邓福珠 毕晓云 何蓉 黄舒 陈晶砺 陈嘉榆 王恒湘 郭子宽

肝硬化是慢性乙型肝炎的常见并发症，晚期出现肝功能的失代偿，以门静脉高压和肝性脑病为主要病理基础，表现为腹水、上消化道出血及神经系统中毒症状。慢性乙型肝炎肝硬化是一种难治性疾病。近年来，抗病毒药物已经在慢性乙型肝炎中广泛应用，但是，阻滞体内病毒复制，只能延缓肝硬化疾病进程，而不能修复既有的肝细胞损伤。肝脏或肝细胞移植是解决该难题的有效手段，但由于肝脏及肝细胞供体缺乏，而乙型肝炎病毒可能在体内持续存在，使移植受者继发病毒性感染，至今仍未成为临床治疗的首选。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是一种源于中胚层的成体干细胞，具有多向分化潜能和免疫调节能力，也可通过释放膜微囊，将生物活性信号传递于受损细胞，从而参与多种组织的损伤修复过程[1-5]。基于此，MSC已经被美国FDA批准，开展150余项临床试验研究。其中，有关自体或异体MSC治疗肝脏纤维化或肝硬化项目26项，细胞应用途径包括外周静脉输注、门静脉或肝动脉输注等。已经报导的临床试验I～II期结果表明，MSC治疗肝硬化可改善部分参试者的肝脏功能，表现为凝血酶原和血清白蛋白浓度的升高，血清胆红素浓度下降，并常伴随腹水减少或消失[6-8]。值得注意的是，培养人MSC传统体系为含胎牛血清的培养基；而在培养过程中，MSC可细胞内化异种蛋白，每108个MSC中牛蛋白含量达到10～30 mg[9]。因此，传统的MSC培养方式，不仅使患者暴露于罹患人畜共患病的风险，也可能因移植细胞死亡释放异体蛋白，引起血清病或其他免疫性疾病。此外，由于血清活性批次间的差异，培养细胞的稳定性不确定。因此，利用无动物源蛋白分子、化学成份清楚的培养基扩增MSC，对治疗的安全性和有效性是十分必要的。本研究主要探讨无血清培养人脐带MSC的特性，以及应用于肝硬化治疗的安全性和有效性。

1 材料与方法

1.1 材料

人脐带由空军总医院妇产科和广州开发区医院妇产科提供，符合实验用人体标本管理规范。

无血清培养基(北京三有利生物技术有限公司)，人MSC培养专用胎牛血清(加拿大Stem Cell公司)，小鼠抗人CD14、CD31、CD44、CD45、CD73(美国BD公司)，维生素C、β磷酸甘油、地塞米松、胰岛素、消炎痛、IMBX(美国Sigma公司)，兔抗人IgG、抗牛血清白蛋白抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白印迹杂交实验

BCA法测定人血清、胎牛血清和无血清培养基中的蛋白浓度。无血清培养基按照每道80 μg上样，人血清上样蛋白量分别为每道25 μg和50 μg，胎牛血清上样蛋白量分别为每道6 μg、30 μg和60 μg。聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。含1%BSA的TBS缓冲液封闭过夜，加入抗人IgG重链或抗牛血清白蛋白抗体，室温反应2 h。洗涤后，加入抗辣根酶标记的小鼠源抗兔抗体，室温反应30 min，化学发光法显示结果。

1.2.2 人脐带MSC的培养

[10]的方法，进行人脐带MSC的分离培养。收集人脐带，PBS冲洗，去除脐静脉、脐动脉和脐带外膜，将组织剪碎，加入Ⅰ型胶原酶消化过夜。收集细胞，悬浮于人MSC无血清培养基中，37℃、5%CO2培养5 d。吸除非贴壁细胞，继续培养至细胞达80%融合，胰蛋白酶消化后传代培养。第3～5代MSC用于治疗。治疗前48 h，取少量培养上清行细菌和真菌培养，取少量细胞行流式细胞学表面抗原分析。

1.2.3 流式细胞学鉴定

人脐带MSC分别用无血清培养基和含10%FCS的α-MEM培养，PBS洗涤后加入PE标记的小鼠抗人CD14、CD31、CD44、CD45和CD73单克隆抗体，室温避光反应20 min，PBS洗涤2次。流式细胞仪(FACSCalibur，BD)收集数据，WinMdi分析结果。

1.2.4 患者选择

入组患者均符合中国《慢性乙型肝炎防治指南(2010)》诊断标准。入组条件为:①慢性乙型肝炎患者；②HBsAg和HBeAg均阳性；③存在肝性脑病、腹水、血清白蛋白浓度下降、总胆红素升高、凝血酶原时间≥4 sec，或其中至少一项；④无严重心、肺及肾功能障碍。

本组共13例，其中男12例，女1例，年龄47～59岁，平均52.3±5.5岁。均为慢性乙型肝炎后肝硬化。Child-Turcotte-Pugh肝功能分级为B级11例，C级2例。本组患者均存在轻或中度黄疸，轻度腹水10例，肝性脑病(Ⅰ级)2例；均存在不同程度血清白蛋白浓度降低，凝血酶原时间≥4 sec患者5例。所有患者均签署细胞治疗知情同意书。

1.2.5 细胞治疗及观察

收集鉴定合格的人脐带MSC，以含1%人白蛋白注射液的生理盐水悬浮细胞，总体积为250 mL，细胞总数5.0×107个。细胞悬液由输血器经外周静脉输注，时间为30～60 min。细胞注射期间及24 h内，监测体温、呼吸、血压，实施心电监护。细胞输注每周1次，4次为一个疗程。治疗前后记录症状变化，测定血清总胆红素和白蛋白浓度，并检测凝血酶原时间。

1.2.6 统计学分析

数据以均数±标准差表示，组间差异采用t检验，P0.05为差异显著。

2 结果

2.1 无血清培养条件下MSC的形态

经胶原酶消化的脐带细胞，在无血清培养基中培养24 h，镜下即可见贴壁细胞，呈纺锤形。72 h后，可见由数个细胞组成的小集落，呈放射状分布(图1)。

图1 原代MSC形态观察。Fig.1Morphological observation of primary MSCs

图2 传代培养的MSC形态观察(100×)Fig.2Morphological observation of the passaged MSCs(100×)

继续培养1周后，贴壁细胞融合度达到80%左右进行传代培养，细胞仍维持成纤维细胞样形态(图2)。结果证明，利用无血清培养基培养获得细胞的形态，符合人MSC判定标准[11]。

2.2 MSC表面标记分析

为鉴定无血清培养基分离培养的细胞，采用流式细胞学技术，以血清培养的MSC作为参考，对细胞表面标记进行分析。结果显示，与常规体系培养的人脐带MSC相似，无血清条件下培养的细胞表达CD44和CD73，不表达CD14、CD31和CD45(图3)，符合国际细胞治疗协会的人MSC判定标准[11]。

图3 MSC表面标记分析Fig.3Analysis on the surface markers of MSCs

2.3 临床观察

本组患者共接受细胞输注52次，细胞输注期间及输注后24 h内均未出现发热、头痛等症状，心电监护均未发现异常。

治疗后，部分患者症状改善，包括食欲好转(10例)、腹胀减轻(7例)、腹水减少(5例)和黄疸减轻或减退(11例)等。2例治疗前存在肝性脑病患者，治疗后神经症状消失。治疗后，血清总胆红素浓度由(79.13±11.34)μM/L下降至(54.58±12.77)μM/L，差异显著(P0.05)；血清白蛋白浓度(33.19±3.25 g/L)较治疗前(32.02±4.17 g/L)略有升高(P0.05)，而凝血酶原时间(18.4±4.1 sec18.8±5.6 sec)无明显变化。Child-Turcotte-Pugh评分(8.1±1.4)较治疗前(8.5±1.5)减低，但无统计学差异(P0.05)。

3 讨论

作为一种细胞药物，MSC已进入临床应用阶段，用于治疗儿童移植物抗宿主病、骨关节疾病及克隆氏病肠瘘等[12]。此外，美国FDA已经批准了多项MSC治疗肝脏纤维化的临床试验。然而，目前多采用含动物或人血清的体系用于骨髓或脐带MSC的培养，临床应用存在安全隐患，尤其是某些动物或人病毒性疾病传播。因此，采用化学成份清晰、无血清且无异种蛋白的体系进行MSC培养，对于保障MSC治疗的安全性是十分必要的[13]。

无血清培养人MSC已有大量的深入研究，如培养体系中加入细胞生长因子[14]或微量元素[15]，或多种细胞生长因子组合[16]，或对细胞培养材料进行表面修饰[17]等。然而，相比含血清体系培养的MSC，由于无血清条件下细胞代谢的特殊性，所获得的MSC在表型及功能上都可能存在差异[18]。本研究结果表明，经无血清条件培养的人脐带MSC，形态呈纤维细胞样，高表达CD44和CD73，不表达内皮细胞标记CD31和血细胞标记CD14、CD45，符合体外培养的人MSC最低鉴定标准[11]。

近年来，对MSC修复肝脏损伤及抗肝纤维化的机制进行了研究。MSC经静脉输注后，主要经肺循环进入肝脏和脾脏，这是MSC治疗肝损伤的细胞动力学基础。同位素标记MSC后扫描发现，输注的细胞首先到达肺脏，之后转移至肝脏和脾脏；其中，输注10 d后，肝脏存在的细胞占总细胞量13%以上[19]。进入肝脏的MSC，可能在肝脏微环境的诱导下，分化为功能性的肝细胞[20]，或与受损肝细胞融合，获得并行使肝细胞的部分功能[21]。移植至肝脏的MSC，或可促进周围细胞金属硫蛋白酶的分泌，以降解周围胶原组织；也可能抑制肿瘤坏死因子和转化生长因子的分泌，阻断肝脏纤维化过程[22-23]。MSC治疗肝脏纤维化的临床试验也表明，细胞治疗后部分患者出现肝功能改善，血清白蛋白浓度升高，总胆红素下降，腹水减轻或消失[6-8]。本组患者经脐带MSC治疗4次后，血清总胆红素浓度明显降低，但血清白蛋白浓度和凝血酶原时间并无显著变化，可能与患者数较少，观察时间较短有关。另外，本组患者均未出现发热、头痛等症状，心电监护也未发现异常，提示使用该剂量(每次5×107个)未发生急性毒性，治疗过程安全顺利。

总之，使用无血清培养人脐带MSC，可保持细胞的固有特性，临床应用未发现急性毒性。进一步长期随访观察将有助于阐明治疗方式的有效性。

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