姜黄素标准样品的研制*

王岱杰，周晓晶，李强，耿岩玲，于金倩，陈静娴，王晓，Dan Staerk

(1.山东省分析测试中心，济南 250014； 2.北京理化分析测试中心，北京 100089)

姜黄素标准样品的研制*

王岱杰1，周晓晶2，李强1，耿岩玲1，于金倩1，陈静娴1，王晓1，Dan Staerk1

(1.山东省分析测试中心，济南 250014； 2.北京理化分析测试中心，北京 100089)

采用硅胶柱色谱和重结晶的方法制备姜黄素标准样品，用UV，IR，MS和NMR等方法对姜黄素标准样品进行结构鉴定，并进行了均匀性、稳定性检验。采用国内8家具有分析资质的实验室进行协同定值，并对定值结果的不确定度进行了评定。姜黄素标准样品的定值结果为99.78%，置信度95%的扩展不确定度(k=2)为0.13%。该姜黄素标准样品可用于有关姜黄素检测方法的校正和相关产品的质量控制。

姜黄素；标准样品；均匀性；稳定性；定值；不确定度

Krywoedscurcumin; certified reference material; homogeneity; stability; certification; uncertainty

姜黄是我国常用大宗药材，为姜科植物姜黄(Curcuma longa L.)的干燥根茎，在我国台湾、福建、广东、广西、云南等省区广泛分布，具有破血行气，通经止痛的功效，用于胸胁刺痛、胸痹心痛、痛经经闭、癥瘕、风湿肩臂疼痛、跌扑肿痛等病症［1］。现代药理学研究表明，姜黄具有抗炎、镇痛、抗血小板凝集、抗肿瘤、抗菌、保肝、降糖降血脂等作用［2-7］。姜黄作为药食同源药材，市场前景广阔，2006年姜黄被WHO制定的《药用植物WHO手册》收录；同时欧盟、美国、加拿大等国家地区均将姜黄及其相关提取物列为食品添加剂进行管理，日本把姜黄、姜黄提取物作为保健食品使用。姜黄素(化学结构式见图1)为橙黄色粉末，是我国药典规定的姜黄药材的高效液相色谱检测指标。姜黄素在食品生产中广泛用于肠类制品、罐头、酱卤制品等产品的着色，因此需要严格控制姜黄素的质量以保证食品的安全性。

目前我国尚无姜黄素标准样品。为了满足姜黄药材、成药分析检测及质量控制工作的需求，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，急需制备姜黄素标准样品。为此笔者采用硅胶柱色谱和重结晶的方法研制了姜黄素标准样品。

图1 姜黄素的化学结构式

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

旋转蒸发仪：R-3型，瑞士BUCHI公司；高效液相色谱仪：1260型，美国Agilent公司；液质联用仪：6520 Q-ToF型，美国Agilent公司；紫外可见分光光度计：UV-2550型，日本岛津公司；

核磁共振波谱仪：INOVA 600型，美国Varian公司；

全自动元素分析仪：Vario ELⅢ型，德国ELEMENTAR公司；

数字熔点仪：WRS-1B型，上海精密科学仪器有限公司；

冷冻干燥仪：SCIENTZ-10N型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

薄层硅胶板GF254：青岛海洋化工厂；

硅胶：G 75～150 μm (100～200目)，青岛海洋化工厂；

硅胶：G 49～75 μm (200～300目)，青岛海洋化工厂；

氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮：分析纯，天津市广成化学试剂有限公司；

实验用水为去离子水；

姜黄药材：购自济南建联中药店，经山东中医药大学鉴定为姜科植物姜黄(Curcuma longa L.)的正品药材。

1.2 姜黄素标准样品制备

将姜黄药材粉碎，置于圆底烧瓶中，用石油醚回流提取3次，每次3 h，滤过。滤渣用丙酮回流提取3次，每次3 h，滤过，得丙酮提取物，即姜黄素类总成分。将提取物反复经硅胶柱色谱分离，氯仿／甲醇梯度洗脱，薄层色谱跟踪监测，收集含姜黄素组分。将收集到含姜黄素较纯部分放置在通风橱内，以乙酸乙酯重结晶，过滤并干燥。

1.3 纯度分析方法

采用等度HPLC、梯度HPLC、薄层色谱、HPLC-MS等多种方法对所制备的姜黄素样品进行纯度检验。

1.3.1 等度HPLC分析条件

色谱柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.5%甲酸水溶液(体积比48∶52)，流速为1.0 mL／min；柱温：30℃；运行时间：30 min；检测波长：430 nm。

1.3.2 梯度HPLC分析条件

色谱柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A为乙腈，B为0.5%甲酸水溶液；梯度洗脱条件：0～20 min，48%A，20～40 min，48%A～100%A，40～50 min，100%A，流速为1.0 mL／min；柱温：30℃；运行时间：50 min；检测波长：430 nm。

1.3.3 薄层色谱条件

硅胶板：GF254；梯度点样(20，40，60，80，100 μg)；展开系统：正己烷-乙酸乙酯(体积比1∶1)、氯仿-甲醇-甲酸(体积比10∶1∶1)；检测方法：荧光检测、日光检测。

1.3.4 MS分析条件

ESI电喷雾离子源；毛细管电压：4.0 kV；载气：普氮，流速为10 L／min，温度为300℃；扫描范围(m／z)：100～1 000。

1.4 结构鉴定

采用UV，IR，MS，NMR等方法对姜黄素进行结构鉴定。

2 结果与讨论

2.1 纯度分析

分别采用等度和梯度HPLC对姜黄素样品进行洗脱，用DAD检测器进行3D扫描，扣除溶剂峰，扫描色谱图未见明显杂质色谱峰。430 nm检测波长下，对姜黄素样品色谱峰进行面积归一化定量，扣除溶剂峰，等度和梯度HPLC所得姜黄素样品纯度分别为99.89%和99.85%。从薄层色谱图看，正己烷-乙酸乙酯(体积比1∶1)和氯仿-甲醇-甲酸(体积比10∶1∶1)展开体系的Rf值分别为0.85和0.64，荧光检测和日光检测未见明显杂质。通过考察姜黄素正离子模式和负离子模式的总离子流图，未见明显杂质峰。

2.2 结构鉴定

采用UV，IR，MS和NMR等方法对姜黄素进行结构鉴定，数据如下。：264.2，429.2 nm；：3 392 (ν)，1628OH(νC=O)，1 601 (νC=C)，1 428 (δCH)，1 282 (νCO)；ESI-MS：m／z 369.1337［ M+H］+，391.1150［ M+Na］+，759.2406［2M+Na］+，306.1885［ M-H］-。1H和13C-NMR数据见表1，表2。以上数据与文献［12-14］比较，确定制得的样品为姜黄素。

表1 姜黄素的核磁共振氢谱数据(氘代溶剂DMSO-d6)

表2 姜黄素的核磁共振碳谱数据(氘代溶剂DMSO-d6)

2.3 均匀性检验

按 照“GB／T 15000.3-2008／ISO Guide 35：2006标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法(7均匀性研究)”要求，采用随机顺序重复测量的方法，从分装后的样品中随机抽取10瓶样品，按3种次序(第1组：1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第2组：10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第3组：2-4-6-8-10-1-3-5-7-9)进行测定。分别从每瓶中称取0.2 mg样品3份，每份样品分别用1.0 mL甲醇(色谱纯）溶解，按1.4等度HPLC分析，以面积百分比读取样品的纯度值。检测数据用方差分析法进行分析。以F检验，确定姜黄素标准样品的均匀性数据是否附合正态分布。检验结果见表3～表5。

表3 均匀性检验结果 %

表4 每瓶测定结果的平均值、方差

表5 均匀性检验方差分析结果

瓶间方差用下式计算：

瓶间标准偏差：

重复性标准偏差可由MSwithin计算：

均匀性引入的不确定度：

由表5可知，υ1=9，υ2=20，查F临界值表得，F0.05(9，20)=2.94，F=MS间／MS内=1.52，F＜ F0.05(9，20)，因此研制的姜黄素标准本样品是均匀的。

2.4 稳定性检验

将姜黄素样品于2～8℃保存，以2年为期，对制备的姜黄素样品每6个月取样检验，按1.4等度HPLC分析，以面积百分比读取样品的纯度值，每份试样以测定5次的平均值为其定值结果，用t检验对数据进行统计分析［8］，稳定性检验结果见表6。

表6 稳定性检验结果

用t检验对数据进行统计分析，采用直线作为经验模型，观察斜率值是否有显著变化，以此对标准样品的稳定性变化进行预测。

斜率按下式计算：

直线上点的标准偏差可由下式计算：

与斜率相关的不确定度用下式计算：

自由度为n-2和95%置信水平的分布t因子为3.182，即：

由于：

因此斜率的变化不显著，即姜黄素标准样品在2年内未观测到明显的不稳定性。

稳定性引入的不确定度：

2.5 定值

按照标准样品工作导则，采用多个实验室协作定值，参加实验室的数目为8个［8-11］。随机抽取24瓶样品，每个定值实验室送3瓶，每瓶平行测定2次。定值实验室将样品配成一定浓度的溶液，用高效液相色谱仪测定，采用峰面积归一化法进行纯度定值。对所采集的测定结果，采用格拉布斯(Grubbs)检验法进行检验，未发现异常值，测定结果呈正态分布。依据高效液相色谱法峰面积归一法所得全部测定结果，计算出姜黄素标准样品的标准值。定值结果见表7。

表7 姜黄素纯度定值结果及不确定度 %

根据表7数据计算测定测定结果的总平均值：

实验室平均值的标准偏差：

总平均值标准偏差：

多家定值引入的不确定度：

u定=sX=0.05%=5.00×10-4

研制的标准样品定值结果的不确定度由以下几部分组成：

(1)均匀性检验引入的不确定度；

(2)稳定性检验引入的不确定度；

(3)多家定值引入的不确定度。

各不确定度分量互不相关，因此合成不确定度：

代入数据计算得： u=0.065%

在置信概率为95%时，k=2，则扩展不确定度U=2u=0.065%×2=0.13%。

3 结论

(1)针对我国缺少姜黄素国家实物标准样品的现状，对姜黄素标准样品进行研制，建立了姜黄素标准样品的制备方法。根据GB／T 15000.3-2008标准样品工作导则，对制得姜黄素样品进行了均匀性、稳定性及定值研究。

(2)制备出标准值为99.78%，扩展不确定度(95%置信区间)为0.13%的姜黄素标准样品，该标准样品符合国家一级标准样品的技术规范要求，填补了国内该领域的研究空白。该标准样品的研制可满足姜黄及相关产品分析检测、质量控制工作的需求，为其检测结果的准确性、可比性和溯源性提供技术支撑和量值溯源保证。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版一部)［M］.北京：化学工业出版社，2010: 247-248.

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［8］GB／T 15000.3-2008／ISO Guide 35:2006 标准样品工作导则(3) 标准样品定值的一般原则和统计方法［S］.

［9］GB／T 15000.1-1994 标准样品工作导则(1) 在技术标准中陈述标准样品的一般规定(等效采用ISO Guide 6 《在国际陈述标准样品的一般规定》)［S］.

［10］GB／T 15000.2-1994 标准样品工作导则(2) 标准样品常用术语和定义(等效采用ISO Guide 30 《标准样品常用术语和定义》)［S］.

［11］GB／T 8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定［S］.

［12］黄伟.温郁金活性成分的研究［D］.杭州：浙江大学，2008: 22-24.

［13］贾淑杰，刘庆焕，王文彤，等.姜黄素、去甲氧基姜黄素和二去甲氧基姜黄素对照品的制备及姜黄素细胞毒性初步研究［J］.中草药，2012，43(6): 1 118-1 121.

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Preparation of Certified Referrence Materials of Curcumin

Wang Daijie1， Zhou Xiaojing2， Li Qiang1， Geng Yanling1， Yu Jinqian1， Chen Jingxian1， Wang Xiao1， Dan Staerk1
(1. Shandong Academy of Sciences， Shandong Analysis and Test Center， Jinan 250014, China; 2. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis， Beijing 100089， China)

Curcumin certified reference material was separated by silica gel column chromatography and recrystallization method. Its chemical structure was identified by UV，IR，MS and NMR. The homogeneity and stability were systematic checked. A cooperative certification was conducted with 8 qualified laboratories. The results showed that the certified value of the reference material of curcumin was 99.78% with the expanded uncertainty of 0.13% (k=2) in confidence coefficient of 95%. The reference material of curcumin can conform to the technical requirement of the certified reference material. The materials can be used for method validation and quality control of regarding products.

O656

A

1008-6145(2014)04-0001-05

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.04.001

*国家质检公益性行业科研专项(201310243)；山东省海外高层次人才资助专项资金项目；北京市科学技术研究院市级财政项目(PXM2013_178305_000009)

联系人：王岱杰；E-mail: wangdaijie@126.com

2014-04-22