N-三甲基壳聚糖不同季铵化程度对塞来昔布脂质体体外性质的影响

龚道凯

(湖北省潜江市中心医院药剂科，湖北 潜江 433100)

塞来昔布(CLX)为非甾体抗炎药，对骨关节炎、风湿性关节炎及外周和中枢疼痛有较好的疗效[1]。目前，CLX 制剂主要为口服的片剂和胶囊剂，易产生胃肠道不良反应及心血管、肝胆及肾脏危害[2-3]，因此积极研制其透皮吸收给药系统有较大的应用前景[4]。由于CLX 的难溶性，在自然条件下穿透完整皮肤较困难，而脂质体作为透皮吸收给药系统的载体，可很好地包封难溶性药物，并可促进药物穿透角质层，在皮肤中蓄积，提高局部药物浓度，同时可减少全身吸收，降低不良反应[5-6]。已有大量研究表明，N-三甲基壳聚糖(TMC)作为一种阳离子多糖，其正电荷与体内负电荷成分作用，可打开细胞间紧密联接，从而促进药物的黏膜及皮肤吸收[7-8]，且促吸收作用与TMC 的季铵化程度(DQ)呈正相关。本试验中拟将不同季铵化程度的TMC 作为透皮促进剂，用于CLX 脂质体(CLXL)中，考察TMC 对CLXL 体外性质的影响及其与季铵化程度之间的关系，为筛选出较好的TMC 类透皮吸收促进剂奠定实验基础。

1 仪器、试药与动物

RE-52C 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);Zetasizer 3000 型HS 激光粒度分析仪(英国Malvern 公司);TEM-100 CXⅡ型透射电镜(日本电子公司);1000 型Agilent 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);EmulsiFlex-C5 型高压均质机(加拿大Avestin 公司);TP-3A 型智能药物透皮扩散实验仪(巩义市科瑞仪器有限公司)。

CLX 原料药(江苏澳新生物工程有限公司，批号为1208137);CLX 对照品(印度Pharma Links 制药公司，批号为CX/1204，含量为99.77%);卵磷脂，胆固醇，维生素E(国药股份有限公司);TritonX-100(日本株式会社);TMC20，TMC40 及TMC60(武汉大学药学院赠予，季铵化程度分别为20.2%，40.1%，64.4%);氮酮(山西芮城兴庆化工厂，批号为121010)。

昆明种健康小鼠，雄性，体重20 ～25 g，购自武汉大学动物实验中心，许可证号为SCXK(鄂)2008-0004。

2 方法与结果

2.1 制剂制备

CLXL:根据预试验结果，并参考文献[6]，采用薄膜分散法制备CLXL。称取卵磷脂140 mg，胆固醇70 mg，维生素E 4 mg，置茄形瓶中，加入适量氯仿溶解，再加入CLX 30 mg，振摇溶解后，置50 ℃水浴中旋转减压蒸发溶剂，直至瓶壁上形成磷脂薄膜，继续蒸发45 min，以完全除去溶剂。取下茄形瓶，加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH=6.5)10 mL，再旋转水化，直至所有磷脂膜均匀混悬于PBS 中。经高压均质机在20 kpsi(1.4 ×106 kPa)压力下经100 nm膜挤压乳匀10 ～15 次，即得CLXL。

TMC 与CLXL 的混合物:分别取TMC20，TMC40，TMC60(与脂材比例为1 ∶4[9]，W/ W)52.5 mg，溶于10 mL CLXL 混悬液中，搅拌均匀，即得3 种TMC 与CLXL 的物理混合物。

含氮酮的CLXL:取氮酮52.5 mg，加入10 mL CLXL 混悬液中，搅拌均匀，即得。

2.2 形态观察

分别取CLXL、含不同季铵化程度TMC 的CLXL 适量，加蒸馏水适当稀释后，取1 滴，滴至覆有支持膜的铜筛网上，用2%磷钨酸溶液染色，自然挥干后样品在100 kV 下以透射电子显微镜进行观察。结果见图1。可见，各种TMC 对CLXL 的形态均不产生显著影响，外观呈圆整球形，粒径较均匀。

2.3 粒径及Zeta 电位测定

分别取CLXL、含不同季铵化程度TMC 的CLXL 适量，用蒸馏水适当稀释后，加入样品池中，用激光粒度分析仪进行测定。结果见图2 和表1。可见，TMC 与CLXL 混合后，CLXL 的平均粒径略有增大，但无显著性差异(P ＞0.05);而Zeta 电位由负转正，且粒径及Zeta 电位均随季铵化程度的增大而逐渐增大，差异具有显著性(P ＜0.05)。

图1 透射电子显微镜照片

图2 CLXL 及TMC60 与CLXL 混合物的粒径及Zeta 电位测定结果

2.4 包封率测定

分别精密吸取CLXL、含不同季铵化程度TMC 的CLXL0.1 mL，置25 mL 容量瓶中，加入10% TritonX-100 溶液0.5 mL，将脂质体充分溶解，用甲醇定容，0.45 μm 微孔滤膜过滤后，取续滤液进样测定[10]，得总药物含量(Cz);另分别精密吸取CLXL、含不同季铵化程度TMC 的CLXL 4.0 mL，置离心管中，并放入超速离心机中，于10 ℃以下以50 000 r/min 的速率离心1 h，离心完毕后，取上清液经微孔滤膜过滤后进样，测定游离药物含量(Cy)。计算包封率Y(%)=(Cz- Cy)/ Cz×100%。结果见表1。可见TMC 对CLXL 的包封率无显著性影响。

表1 各种CLXL 粒径及Zeta 电位测定结果(n=3)

2.5 小鼠离体皮肤渗透性考察

断颈法处死小鼠，剔除背部毛发，剥取皮肤，除去皮下组织和脂肪，生理盐水漂洗干净，泡于生理盐水中，4 ℃冰箱保存，24 h内使用;Franz 扩散池透皮有效面积为1.32 cm2，接受池体积为15 mL，磁力搅拌速度为200 r/min，(32 ±1)℃恒温水浴，接受液为含30%甲醇的磷酸盐缓冲液(pH=6.5);将小鼠离体皮肤固定在供给池与接受池之间，角质层面向供给池，接受液液面恰与皮肤下层接触，无气泡。供给池分别给予CLXL、含不同季铵化程度TMC 的CLXL 及含氮酮的CLXL 各1.0 mL，分别于给药后0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，19.0，24.0 h 时精密吸取接受液2.0 mL，同时补充同温、同量的新鲜接受液。取出的接收液经0.45 μm 微孔滤膜过滤，续滤液适当稀释后进样测定药物浓度Cn，按以下公式计算累积渗透量Q。

式中Cn 为第n 个取样点的药物浓度(μg/mL)，V 为取样体积(mL)，A 为渗透面积。

以Q(μg/cm2)为纵坐标、时间t(h)为横坐标作图，得Q- t曲线(n=3)，见图3(Q4 与Q5 几乎重合)。将数据进行模型拟合，取相关系数最大者为最佳拟合方程，结果见表2。结果表明，5 种CLXL 体外透皮特征均符合Higuchi 方程，其方程斜率即为稳态透皮速率J[μg /(cm2·h)]。与CLXL 相比，各种TMC 均产生明显的透皮吸收促进效果(P ＜0.05)，且随着季铵化程度的增加，促进效果越明显，其中TMC60 与氮酮相比，促进作用无显著性差异(P ＞0.05)。

图3 体外累积透皮量Q 与时间t 的关系曲线(n=3)

3 讨论

药物既要有一定的亲水性，又要有一定的亲脂性，才能穿透完整的皮肤。CLX 为难溶性药物，在自然情况下很难透皮吸收。本试验的主要目的是利用脂质体为载体，较好地包封CLX，并利用脂质体的皮肤吸收促进作用，结合阳离子多糖TMC 为吸收促进剂，达到提高CLX 透皮吸收效果的目的。前期试验已经证实，TMC 与CLXL 混合使用的促进效果要明显高于TMC 包衣CLXL，故本试验采用不同季铵化程度TMC 与CLXL 混合，并着重探讨其促渗效果与季铵化程度之间的关系。由于季铵化程度在20% ～80%之间的TMC 水溶性较好，而季铵化程度高于60%时合成较困难，故本试验选用季铵化程度的范围为20% ～60%。

表2 体外累积透皮量Q 与时间t 的拟合方程

本试验结果表明，TMC 与CLXL 混合后，CLXL 的粒径有所增加，可能的原因是CLXL 带负电，TMC 带正电，由于静电吸引，有部分TMC 吸附于CLXL 表面，从而使粒径增大，且随着季铵化程度的增加，TMC 所带正电荷增加，吸附作用更加明显，粒径也相应增大;同时，也使整个体系的Zeta 电位由混合前的负电荷转变为混合后的正电荷;但TMC 对CLXL 的形态及包封率并无显著性影响。

体外透皮试验结果证实，TMC 对CLXL 的透皮促进作用，且与其季铵化程度呈明显的正相关，从而表明其作用机理与其所带正电荷与皮肤中负电荷成分相互作用有关[8]。有关体内相关研究正在进行中。

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