清营口服液的安全性和临床药效研究

闫绍悦等

摘 要：为验证新药清营口服液的安全性和有效性，进行了Wistar大鼠的安全性试验和SPF鸡临床疗效试验。在40～10 g/kg b.w.剂量范围内，经口给予清营口服液30 d后，检查Wistar大鼠的一般生理状态及血液生理、生化指标，并进行病理解剖及病理组织学检查。结果表明清营口服液各剂量组所有检测指标，与阴性对照组无显著差异（P>0.05），且对Wistar大鼠的生长发育未产生影响，较长期重复应用无亚急性毒性，说明该药安全性较强：通过对比清营口服液试验组和氟苯尼考对照组对SPF鸡的疗效发现清营口服液组能够对体内注射的大肠杆菌起到较好的抑菌和杀菌效果，从试验鸡的死亡率和分菌结果可以看出清营口服液总体预防和治疗效果好于氟苯尼考，说明清营口服液有较好的临床抗菌效果。

关键词：清营口服液；大鼠；安全性试验；大肠杆菌；抗菌效果

中图分类号：S853.76 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0117-04

清营口服液是山东省农业科学院家禽研究所研制的新型中兽药口服液，其处方主要来源于中医清营凉血的著名经方清营汤，功效为清营解毒，透热养阴，主治温热病邪传入营分证。本实验室通过临床试验发现，清营口服液对治疗鸡大肠杆菌病具有切实疗效。中医药是祖国医学的瑰宝， 且被广泛应用于临床工作中，长期以来， 许多人认为中药药性缓和， 毒副作用小而安全， 中药临床应用的安全问题不够重视。但近年关木通、龙胆泻肝丸致急性肾衰竭[1]，双黄连注射液、鱼腥草注射液致过敏休克[2，3]等不良反应报道，使人们对中药应用的安全性产生了怀疑。为了解新药清营口服液在使用过程中的安全性，进行了Wistar大鼠相关安全性试验，并采用SPF鸡为实验动物验证其抗菌疗效。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 健康Wistar大鼠80只，体重140～180 g，雌、雄各半，购自山东省实验动物中心。7日龄SPF鸡，平均体重105.5 g，购自山东昊泰特种动物繁育有限公司。

1.1.2 试验菌株 大肠杆菌，编号09-29，血清型O24，山东省农业科学院家禽研究所保存。

1.1.3 试验药品和试剂 清营口服液，山东省农业科学院家禽研究所研制，由犀角、生地黄、玄参、黄连、金银花、甘草等组成，委托烟台绿叶动物保健品有限公司生产，批号为20120314，生药含量2 000 mg/mL。氟苯尼考可溶性粉，山东昊泰科技药业有限公司生产，批号20100925，含量为10%。哺乳动物血常规分析配套试剂，生化指标测定配套试剂，组织标本固定用试剂，普通固、液体培养基。

1.1.4 主要仪器 OLYMPUS Au2700全自动生化分析仪、Sysmex F-820型全自动血常规分析仪、生物显微镜、紫外分光光度计、离心机、组织切片机、超净工作台、振荡摇床、恒温培养箱、隔离器等。

1.2 试验方法

1.2.1 安全性试验 ①清营口服液对大鼠自然状况和体重的影响：本试验受试药物清营口服液对Wistar大鼠的经口最大耐受剂量（MTD）大于40 g/kg b.w.。因此本试验将80只健康Wistar大鼠随机分为高（40 g/kg b.w.）、中（20 g/kg b.w.）、低（10 g/kg b.w.）3个剂量组和1个阴性对照组，每组20只，雌雄各半。剂量组连续经口给药30 d，阴性对照组给予相同量的无菌蒸馏水灌胃，每日给药和灌胃时间一致。试验期间，每天观察记录大鼠的一般行为表现、中毒及死亡情况，每7天测量记录试验大鼠体重、投入饲料量及剩余饲料量。

②血液生理、生化指标测定：试验结束后各组取20只大鼠（雌、雄各半）采血样，用全自动血液生理指标分析仪和自动血液生化指标分析仪分别测定血液生理和生化指标。血液生理指标包括：红细胞数（RBC）、白细胞数（WBC）、血红蛋白（HHb）、血小板数（PLT）、单核细胞数、嗜酸性粒细胞数。血液生化指标包括：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、肌酐（CRE）、血糖（GLUC）、总蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）等。

③病理学检查：采血结束后，对各组大鼠（雌、雄各半）进行剖检，观察病变并做好记录；剖检大鼠的同时，称量各主要脏器（包括肝、肾、脾、睾丸）重量，计算各脏器的相对重量（脏/体比值）；取高剂量组剖检20只大鼠心、肝、脾、肾、胃肠、睾丸、卵巢和胸腺组织，石蜡包埋，切片，H-E染色，于普通光镜下观察有无病理变化，若发现病变再对较低剂量组大鼠的相应器官及组织进行检查。

1.2.2 临床药效试验 ①临床试验方法：将60只SPF雏鸡，平均分成4组，每组15只，分别为清营口服液试验组、氟苯尼考试验组、单独攻菌对照组、空白对照组。除空白对照组外，每组鸡腹腔注射0.1 mL/只大肠杆菌菌液（用前培养至浓度为3×1010 cfu/mL）。清营口服液试验组、氟苯尼考试验组分别于攻菌前一天口服用药两次，每次0.2 mL；攻菌当天分别口服用药3次，每次0.3 mL；攻菌后一天每组口服用药两次，每次0.3 mL。单独攻菌组和空白对照组不用药，但按照用药组程序每次口服同剂量的生理盐水。

②精神状态、病理变化和分菌计数记录：从服药开始每组鸡每隔8 h观察记录精神状态和死亡情况，并于攻菌后48 h将存活鸡处死，连同已死鸡进行剖检、分菌计数。剖检过程中，完整摘取胸腺和脾脏称重，计算每组鸡免疫器官指数。免疫器官指数=免疫器官重量/体重×100。

③体温测定和白细胞计数：四组试验鸡分别于攻菌前和攻菌后4、8、12、16、20、24、28、32、36、48 h测定体温，并在攻菌前和攻菌后4、8、12、16、20、24、28、32、36 h采血进行白细胞计数。endprint

2 结果与分析

2.1 安全性试验

2.1.1 清营口服液对大鼠自然状况和体重的影响 经口给予大鼠清营口服液进行30天喂养试验，在试验过程中，观察到各组大鼠的进食、饮水、精神状态、活动状况、被毛光泽度均无异常变化，体重均在正常范围内增长。对表1中受试物各剂量组大鼠和阴性对照组大鼠体重进行t 检验，结果表明，在试验结束后受试物各剂量组大鼠的体重与阴性对照组相比差异不显著（P>0.05）。

2.1.2 清营口服液对大鼠血液生理、生化指标的影响 大鼠血液生理指标的t检验结果（见表2）表明，受试物各剂量组大鼠的红细胞数（RBC）、白细胞数（WBC）、血红蛋白（HHb）、血小板数（PLT）、单核细胞数、嗜酸性粒细胞数与阴性对照组相比差异不显著（P>0.05）。大鼠血液生化指标测定结果见表3，可以看出，受试物3个剂量组大鼠的血液生化指标与阴性对照组大鼠相应指标均在正常范围内，且差异不显著（P>0.05）。

2.1.3 大鼠的病理学检查结果 剖检结果显示受试物3 个剂量组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺、胃和肠与阴性对照组大鼠的各相应脏器比较无肉眼可见的病理变化；脏/体比值结果见表4。统计学分析显示，清营口服液各剂量组的脏器系数与阴性对照组相比，差异不显著（P>0.05）；组织切片结果显示受试物各剂量组与阴性对照组所有剖检大鼠心、肝、脾、肾、肠和胸腺组织未见任何明显病理变化。

2.2 临床药效试验结果

2.2.1 精神状态、病理变化和分菌计数 从攻菌后8 h到试验结束期间清营口服液组试验鸡的精神状态（表5 ）好于氟苯尼考组和单独攻菌组，死亡率明显低于氟苯尼考组和单独攻菌组。分菌结果（表5）显示清营口服液组无菌鸡只数明显高于氟苯尼考组和单独攻菌组。各组随机取2只死鸡剖检可见胸腹气囊炎、肝周炎、心包炎、脾脏肿大等病理变化。免疫器官指数结果（见表6）显示清营口服液组胸腺指数显著低于其它三组 （P<0.05），而脾脏指数显著高于其它三组（P<0.05）。

2.2.2 体温测定和白细胞计数 体温测定结果（表7）显示，清营口服液组试验鸡在攻菌后16～28 h体温一直处于较高阶段，与其它三组比较，体温差别变化不大。白细胞计数结果（表8）显示清营口服液组白细胞数与空白对照组变化不大。

3 结论与讨论

通过连续给药30 d，清营口服液各剂量组动物生长发育良好，体重、脏器系数、血常规和血液生化指标等各项指标与对照组之间均无统计学差异，且均在正常范围。其中母鼠的体重、增重、耗料及饲料利用率较公鼠的少，可解释为性别差异所造成。综上所述，在本试验条件下，未发现清营口服液对Wistar大鼠的生长发育产生影响，长期重复应用无亚急性毒性，清营口服液的安全性较好。

通过与氟苯尼考试验组比对，发现清营口服液组预防和治疗效果好于氟苯尼考组。其作用机理不仅仅是直接对细菌的杀灭作用，通过攻菌后试验鸡的白细胞计数和脾脏免疫器官指数明显高于氟苯尼考试验组和单独攻菌组和空白对照组可推知，清营口服液应该在体内提高机体免疫应答水平，促进免疫器官发育和体液免疫。但本试验体温组间变化不大，清营口服液组试验鸡在攻菌后16～28 h体温一直处于较高阶段，而且该阶段该试验组鸡白细胞数变化不明显，但死亡率有所提高，可能原因为此时间段大肠杆菌在体内繁殖达到顶峰而中药作用还没有达到最佳疗效，说明中药治疗起效有一个时间段，需要在体内有一个二次代谢或者激发免疫应答过程，该药的使用能将提前预防和治疗结合起来才是最佳用药方式。另外清营口服液组胸腺指数明显低于其他组，剖检发现其胸腺大都萎缩，由此推断可能是该药主要激发机体的体液免疫而对细胞免疫刺激作用不强导致，具体原因还需进一步试验印证。总体而言，上述试验证实，清营口服液具有较好的安全性和临床药效，适合作为治疗由大肠杆菌相关病因导致的家禽热证的药物。

参 考 文 献：

[1] 李锋， 程庆砾， 董柯，等. 对13例木通中毒导致急性肾功能衰竭的分析[J].中国中药杂志，1999，24（7）：435-437.

[2] 吕福云，冀润利，王淑华.双黄连注射液致过敏性休克 2 例 [J].天津医药，2005，33（3）：163-165.

[3] 曾聪彦，梅全喜. 鱼腥草注射液致过敏性休克62例文献分析[J]. 中国医院用药评价与分析，2008，8（11）：865-867.endprint

2 结果与分析

2.1 安全性试验

2.1.1 清营口服液对大鼠自然状况和体重的影响 经口给予大鼠清营口服液进行30天喂养试验，在试验过程中，观察到各组大鼠的进食、饮水、精神状态、活动状况、被毛光泽度均无异常变化，体重均在正常范围内增长。对表1中受试物各剂量组大鼠和阴性对照组大鼠体重进行t 检验，结果表明，在试验结束后受试物各剂量组大鼠的体重与阴性对照组相比差异不显著（P>0.05）。

2.1.2 清营口服液对大鼠血液生理、生化指标的影响 大鼠血液生理指标的t检验结果（见表2）表明，受试物各剂量组大鼠的红细胞数（RBC）、白细胞数（WBC）、血红蛋白（HHb）、血小板数（PLT）、单核细胞数、嗜酸性粒细胞数与阴性对照组相比差异不显著（P>0.05）。大鼠血液生化指标测定结果见表3，可以看出，受试物3个剂量组大鼠的血液生化指标与阴性对照组大鼠相应指标均在正常范围内，且差异不显著（P>0.05）。

2.1.3 大鼠的病理学检查结果 剖检结果显示受试物3 个剂量组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺、胃和肠与阴性对照组大鼠的各相应脏器比较无肉眼可见的病理变化；脏/体比值结果见表4。统计学分析显示，清营口服液各剂量组的脏器系数与阴性对照组相比，差异不显著（P>0.05）；组织切片结果显示受试物各剂量组与阴性对照组所有剖检大鼠心、肝、脾、肾、肠和胸腺组织未见任何明显病理变化。

2.2 临床药效试验结果

2.2.1 精神状态、病理变化和分菌计数 从攻菌后8 h到试验结束期间清营口服液组试验鸡的精神状态（表5 ）好于氟苯尼考组和单独攻菌组，死亡率明显低于氟苯尼考组和单独攻菌组。分菌结果（表5）显示清营口服液组无菌鸡只数明显高于氟苯尼考组和单独攻菌组。各组随机取2只死鸡剖检可见胸腹气囊炎、肝周炎、心包炎、脾脏肿大等病理变化。免疫器官指数结果（见表6）显示清营口服液组胸腺指数显著低于其它三组 （P<0.05），而脾脏指数显著高于其它三组（P<0.05）。

2.2.2 体温测定和白细胞计数 体温测定结果（表7）显示，清营口服液组试验鸡在攻菌后16～28 h体温一直处于较高阶段，与其它三组比较，体温差别变化不大。白细胞计数结果（表8）显示清营口服液组白细胞数与空白对照组变化不大。

3 结论与讨论

通过连续给药30 d，清营口服液各剂量组动物生长发育良好，体重、脏器系数、血常规和血液生化指标等各项指标与对照组之间均无统计学差异，且均在正常范围。其中母鼠的体重、增重、耗料及饲料利用率较公鼠的少，可解释为性别差异所造成。综上所述，在本试验条件下，未发现清营口服液对Wistar大鼠的生长发育产生影响，长期重复应用无亚急性毒性，清营口服液的安全性较好。

通过与氟苯尼考试验组比对，发现清营口服液组预防和治疗效果好于氟苯尼考组。其作用机理不仅仅是直接对细菌的杀灭作用，通过攻菌后试验鸡的白细胞计数和脾脏免疫器官指数明显高于氟苯尼考试验组和单独攻菌组和空白对照组可推知，清营口服液应该在体内提高机体免疫应答水平，促进免疫器官发育和体液免疫。但本试验体温组间变化不大，清营口服液组试验鸡在攻菌后16～28 h体温一直处于较高阶段，而且该阶段该试验组鸡白细胞数变化不明显，但死亡率有所提高，可能原因为此时间段大肠杆菌在体内繁殖达到顶峰而中药作用还没有达到最佳疗效，说明中药治疗起效有一个时间段，需要在体内有一个二次代谢或者激发免疫应答过程，该药的使用能将提前预防和治疗结合起来才是最佳用药方式。另外清营口服液组胸腺指数明显低于其他组，剖检发现其胸腺大都萎缩，由此推断可能是该药主要激发机体的体液免疫而对细胞免疫刺激作用不强导致，具体原因还需进一步试验印证。总体而言，上述试验证实，清营口服液具有较好的安全性和临床药效，适合作为治疗由大肠杆菌相关病因导致的家禽热证的药物。

参 考 文 献：

[1] 李锋， 程庆砾， 董柯，等. 对13例木通中毒导致急性肾功能衰竭的分析[J].中国中药杂志，1999，24（7）：435-437.

[2] 吕福云，冀润利，王淑华.双黄连注射液致过敏性休克 2 例 [J].天津医药，2005，33（3）：163-165.

[3] 曾聪彦，梅全喜. 鱼腥草注射液致过敏性休克62例文献分析[J]. 中国医院用药评价与分析，2008，8（11）：865-867.endprint

2 结果与分析

2.1 安全性试验

2.1.1 清营口服液对大鼠自然状况和体重的影响 经口给予大鼠清营口服液进行30天喂养试验，在试验过程中，观察到各组大鼠的进食、饮水、精神状态、活动状况、被毛光泽度均无异常变化，体重均在正常范围内增长。对表1中受试物各剂量组大鼠和阴性对照组大鼠体重进行t 检验，结果表明，在试验结束后受试物各剂量组大鼠的体重与阴性对照组相比差异不显著（P>0.05）。

2.1.2 清营口服液对大鼠血液生理、生化指标的影响 大鼠血液生理指标的t检验结果（见表2）表明，受试物各剂量组大鼠的红细胞数（RBC）、白细胞数（WBC）、血红蛋白（HHb）、血小板数（PLT）、单核细胞数、嗜酸性粒细胞数与阴性对照组相比差异不显著（P>0.05）。大鼠血液生化指标测定结果见表3，可以看出，受试物3个剂量组大鼠的血液生化指标与阴性对照组大鼠相应指标均在正常范围内，且差异不显著（P>0.05）。

2.1.3 大鼠的病理学检查结果 剖检结果显示受试物3 个剂量组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺、胃和肠与阴性对照组大鼠的各相应脏器比较无肉眼可见的病理变化；脏/体比值结果见表4。统计学分析显示，清营口服液各剂量组的脏器系数与阴性对照组相比，差异不显著（P>0.05）；组织切片结果显示受试物各剂量组与阴性对照组所有剖检大鼠心、肝、脾、肾、肠和胸腺组织未见任何明显病理变化。

2.2 临床药效试验结果

2.2.1 精神状态、病理变化和分菌计数 从攻菌后8 h到试验结束期间清营口服液组试验鸡的精神状态（表5 ）好于氟苯尼考组和单独攻菌组，死亡率明显低于氟苯尼考组和单独攻菌组。分菌结果（表5）显示清营口服液组无菌鸡只数明显高于氟苯尼考组和单独攻菌组。各组随机取2只死鸡剖检可见胸腹气囊炎、肝周炎、心包炎、脾脏肿大等病理变化。免疫器官指数结果（见表6）显示清营口服液组胸腺指数显著低于其它三组 （P<0.05），而脾脏指数显著高于其它三组（P<0.05）。

2.2.2 体温测定和白细胞计数 体温测定结果（表7）显示，清营口服液组试验鸡在攻菌后16～28 h体温一直处于较高阶段，与其它三组比较，体温差别变化不大。白细胞计数结果（表8）显示清营口服液组白细胞数与空白对照组变化不大。

3 结论与讨论

通过连续给药30 d，清营口服液各剂量组动物生长发育良好，体重、脏器系数、血常规和血液生化指标等各项指标与对照组之间均无统计学差异，且均在正常范围。其中母鼠的体重、增重、耗料及饲料利用率较公鼠的少，可解释为性别差异所造成。综上所述，在本试验条件下，未发现清营口服液对Wistar大鼠的生长发育产生影响，长期重复应用无亚急性毒性，清营口服液的安全性较好。

通过与氟苯尼考试验组比对，发现清营口服液组预防和治疗效果好于氟苯尼考组。其作用机理不仅仅是直接对细菌的杀灭作用，通过攻菌后试验鸡的白细胞计数和脾脏免疫器官指数明显高于氟苯尼考试验组和单独攻菌组和空白对照组可推知，清营口服液应该在体内提高机体免疫应答水平，促进免疫器官发育和体液免疫。但本试验体温组间变化不大，清营口服液组试验鸡在攻菌后16～28 h体温一直处于较高阶段，而且该阶段该试验组鸡白细胞数变化不明显，但死亡率有所提高，可能原因为此时间段大肠杆菌在体内繁殖达到顶峰而中药作用还没有达到最佳疗效，说明中药治疗起效有一个时间段，需要在体内有一个二次代谢或者激发免疫应答过程，该药的使用能将提前预防和治疗结合起来才是最佳用药方式。另外清营口服液组胸腺指数明显低于其他组，剖检发现其胸腺大都萎缩，由此推断可能是该药主要激发机体的体液免疫而对细胞免疫刺激作用不强导致，具体原因还需进一步试验印证。总体而言，上述试验证实，清营口服液具有较好的安全性和临床药效，适合作为治疗由大肠杆菌相关病因导致的家禽热证的药物。

参 考 文 献：

[1] 李锋， 程庆砾， 董柯，等. 对13例木通中毒导致急性肾功能衰竭的分析[J].中国中药杂志，1999，24（7）：435-437.

[2] 吕福云，冀润利，王淑华.双黄连注射液致过敏性休克 2 例 [J].天津医药，2005，33（3）：163-165.

[3] 曾聪彦，梅全喜. 鱼腥草注射液致过敏性休克62例文献分析[J]. 中国医院用药评价与分析，2008，8（11）：865-867.endprint