肺部给药用高分子多孔微球的制备及改性研究进展

朱利会 ，陈爱政 ，2，王士斌 ，2

（1华侨大学化工学院，福建 厦门 361021；2华侨大学生物材料与组织工程研究所，福建 厦门 361021）

肺部给药是一种将药物通过吸入传递到肺部，来治疗肺部疾病或者实现全身治疗的给药途径。与经注射、口服给药等相比，肺部给药具有以下优点[1-2]：①吸收表面积大（100 m2）；②毛细血管丰富、血流量大；③上皮细胞层薄（0.1～0.2μm）、物质交换距离短、药物吸收屏障小，速度快；④生物代谢酶活性低，无肝脏首过效应；⑤患者适应性好。因此，肺部给药是一种极具发展潜力的给药途径，特别是对于一些生物利用度低的大分子药物的传递。肺部给药制剂包括：喷雾剂、定量吸入气雾剂（MDI）和干粉雾剂（DPI）。喷雾剂的喷射雾化过程是连续的，而人的吸气呼气是交替进行的，易造成药物浪费；MDI则由于抛射剂的选择限制了其应用；DPI依靠患者主动吸入，安全无刺激，但药物的微细化关系到药物能否实现有效的肺部沉积。

随着制剂技术的发展，又出现了脂质体、纳米颗粒、实心微球、多孔微球等肺部给药新剂型。脂质体与肺表面活性物质亲和性好，但脂质体不稳定，会诱导氧自由基产生肺部毒性。纳米颗粒吸入后往往被呼出体外或被肺泡吞噬细胞吞噬，通常以下列方式进行可吸入给药[3-5]：①分散在不规则载体上；②形成“Trojan”颗粒；③镶嵌在实心微球中，但仍然只有少部分到达肺。实心微球空气动力学性能差，吸入后易滞留在肺的浅层组织。多孔微球作为新型的药物载体，具有适合肺部给药的优势[6-7]：①比表面积大，密度低；②多孔结构利于药物的吸附，提高载药量和包封率，通过调整多孔结构可调控包载药物的释放速度；③粉末性能好，尤其是几何粒径（Dg）介于10～30μm之间，空气动力学粒径（Da）介于 1～5μm 之间，ρ<0.4g/cm3的多孔微球既能实现肺部深层靶向，又能避免被吞噬细胞吞噬。另外，微球高分子材料的选择也是药物制剂的关键，常见的有壳聚糖、聚乙内酯（PCL）、聚L-乳酸（PLLA）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）等[8-11]，其生物相容性好，易加工改性。为保证肺部给药的有效性，微球的制备尤为重要，因此，本文将以肺部给药用高分子多孔微球为核心，重点从多孔微球的制备和改性两大方面展开综述。

1 肺部给药载体多孔微球的制备方法

1.1 乳化法

制备多孔微球最传统的方法是双重乳化（W/O/W）-溶剂挥发法，孔洞的形成与有机溶剂的挥发及内水相的去除有密切关系，溶剂的种类、挥发速度、内水相去除的速度等均会影响微球的形貌和孔隙率。改良的 W/O/W 法避免了上述诸多因素的影响，在传统方法的基础上加入致孔剂来形成微球内部及表面的多孔结构。按成孔机制，致孔剂包括渗透性致孔剂、泡腾致孔剂、可抽提的致孔剂（如图1）。

1.1.1 渗透性致孔剂

渗透性致孔剂在乳滴内水相形成高渗透压，吸引水从外水相进入内水相，成球后内水相的水分经冷冻干燥移除，微球即呈多孔。常见的渗透性致孔剂有β-丙羟基环糊精（HP-β-CD）、牛血清蛋白（BSA）、聚乙烯亚胺（PEI）等。其中HP-β-CD不仅可以有效地致孔，而且对药物的吸附有一定的促进作用，提高药物稳定性，调节药物从微球的释放，实现药物的缓控释。利用HP-β-CD作为致孔剂制备的多孔微球，空气动力学性能（MMAD≈3μm）良好，满足肺部给药要求，特别适合包载蛋白质、多肽类药物[12-13]。

Lee等[14]用W/O/W法，以BSA为致孔剂制备了PLGA多孔微球，分别调节BSA和PLGA的浓度，可以独立操控多孔微球的粒径和孔径，二者不存在依赖性；BSA的使用降低了药物分子胰岛素和血管内皮生长因子的突释，尤其后者的缓释时间长达两周，体现了肺部药物传递系统的优势。Gupta等[15]以PEI为致孔剂制备的PLGA多孔微球，孔隙率随PEI质量分数的增长而增长。

图1 3种微球成孔机制

此方法操作简便易行，微球成形性好，粒径分布比较均匀，但是大多数情况下，由于其致孔过程依赖内水相的去除，容易造成药物分子尤其是水溶性药物的流失，最终导致多孔微球载药量降低，无法达到理想的药效，所以此方法在提高载药量方面的改进还有待进一步的研究与优化。

1.1.2 泡腾致孔剂

泡腾致孔剂致孔原理是在内水相中加入碳酸氢铵（ammonium bicarbonate，AB）、过氧化氢（H2O2）等物质，它们在一定条件下可以分解产生NH3、CO2或O2等气体，气体从乳滴（成球前）或微球（成球后）内逃逸，从而在微球内部及表面形成多孔结构。

Bae等[16]以 H2O2为致孔剂，采用 W1/O/W2法制备了PLGA多孔微球，其中H2O2含量越高，孔径越大，孔隙率越高；但该致孔过程依赖 H2O2的酶解反应，酶活性的保持限制了其应用。Yang等[1]以AB为致孔剂制备的PLGA多孔微球的Dg是10～20μm，Da是 4.0μm，FPF（粒径≤4.7μm 的微球百分数）是32.0%；该致孔过程是由AB分解发泡引起的，不存在溶质的扩散作用，因此不会引起药物的流失，而且发泡过程导致聚合物相的气压降低，加速了微球的固化，反而有利于提高包药物的封率；载药后微球的各项性能仍然非常符合肺部给药要求（Dg介于 10～30μm 之间，Da介于 1～5μm 之间）。

目前，此方法是采用最广泛的微球致孔方法，其中以AB致孔效果最佳，随着内水相中AB的量的逐渐增加，微球的孔隙率，孔径也在逐渐增加[17-19]。泡腾致孔剂在一定条件下分解产生气体，可加速微球的固化速率，从而提高了药物的包封率，但是如何形成开放式及更均一的多孔结构，实现微球粒径和孔径的分别可控，以达到最佳的肺部靶向效果还有待进一步的研究。

1.1.3 可抽提的致孔剂

根据相似相溶原理，实心微球包埋的油、脂类物质被其可溶的溶剂抽提出来，即可得到多孔微球。Ahmed等[20]用W/O/W法，将甘油单油酸酯包埋在聚合物相，然后由己烷进行抽提致孔，得到的微球表面不规整，球形度相对较差，这是因为有机溶剂挥发较快，乳化时外部水相的水扩散到初始液滴，液滴内部膨胀，球形度变差。Arnold等[21]分别以菜籽油、硅油为致孔剂，最后用庚烷来进行抽提致孔，得到的多孔微球都有良好的空气动力学性质，呈现了良好的肺部靶向效果。

另外，除了油脂类物质被有机溶剂抽提，还有油酸钠等强亲水性物质被外部水相抽提致孔，其水溶性强，在乳化成球过程中迅速外流到外水相而形成孔道。Sun等[22]选用油酸钠为致孔剂，因其具有较高的亲水/亲油平衡值（HLB=18），很容易快速从聚合物相流到外部水相，形成三维网络孔道，并且孔径的变化依赖粒径的变化。

该方法涉及有机溶剂的萃取加速相分离过程，存在一定的有机残留问题，或者由于抽提的时间掌握不好均会影响多孔微球的形貌和空气动力学性能，所以具体的优化研究还有待进一步探索。以上3种改良的 W/O/W 法制备多孔微球操作均相对简单，结果各有特点，如果能够把各种方法的优势相互结合，有望制备出粒径更加均一的多孔微球。

1.2 相分离法

一个多组分均相体系，在一定的理化条件下从稳态转化为非稳态，体系由均相分离成多相，这就是相分离。该方法最初是用于多孔膜的制备，随后，也在乳化的基础上用于制备多孔微球。Dai等[23]采用非溶剂/溶剂诱导的相分离法制备了表面具有酒窝状结构的“高尔夫球”状微球，其空气动力学性能较差，不适合肺部给药。Kim等[24]在乳化的基础上，将Pluronic F127溶液加入到聚合物溶液中，溶剂的挥发使Pluronic F127相与聚合物相发生分离，然后洗去Pluronic F127，即得到多孔微球，该方法制备微球简单易操作，条件温和，但是一部分结晶性高分子材料在一定条件下没有适当的溶剂，所以该方法也有一定的局限性。

1.3 静电喷射技术

静电喷射法制备微球是指在高压条件下，喷射装置与接收装置之间形成电场，带电的喷射液克服自身表面张力的变化劈裂为小的液滴，滴落到接收装置固化成球。该方法制备微球简单高效，制得的微球表面光滑，粒径分布范围窄，因带相同电荷的微球之间相互排斥，微球分散性较好，微球的形貌及粒径可通过调整工艺参数实现可控[25-28]。

图2 高压静电抗溶剂法制得的PLLA多孔微球扫描电镜照片[31]

Zhang等[29]采用静电喷射法制备的多孔微球粒径分布为3～20μm，但微球内部孔洞贯通性较差，表面多孔开放性较差，不适合肺部给药。本文作者课题组[30-31]采用高压静电抗溶剂法制备了甲氨蝶呤（MTX）-PLLA微球，微球球形度、分散性均较好；随后，在此基础上加入致孔剂成功制备了多孔微球，结果表明，多孔微球的Dg为25μm，Da为3.1μm（如图2），符合肺部给药用载体的空气动力学性质要求（Dg介于 10～30μm之间，Da介于 1～5μm之间）；载药后多孔微球的空气动力学性能没有明显变化，仍适合肺部给药。目前，采用该技术制备多孔微球的研究相对较少，工艺的优化及如何形成更加均一的多孔结构是制备的关键。

1.4 超临界流体技术

超临界流体指的是处于临界点以上温度和压力下的流体，其密度接近液体，黏度接近气体，是很好的溶剂。Koushik等[32]]利用该技术使超临界-二氧化碳（SC-CO2）包埋于聚合物中，然后降压使CO2逸出制备了多孔微球，但此方法依赖CO2的溶胀作用致孔，得到的微球孔隙率太低，空气动力学性能较差，可能不适合肺部给药。作者课题组[33-36]根据近几年国内外利用该技术制备多孔微球的进展，总结了该技术制备多孔微球的几种不同的机理，总结了应用CO2抗溶剂原理造粒技术的研究进展，并采用CO2抗溶剂法首次成功制备了高孔隙率的可吸入PLLA多孔微球（如图3），致孔剂的加入增加了微球的孔隙率，得到的多孔微球Dg为 10～25μm，ρ<0.4g/cm3；载溶菌酶（LSZ）多孔微球的Da<4.7μm，Dg>10μm，均满足肺部给药要求，并且LSZ在超临界过程中没有发生结构改变，依然保持活性。结果表明，超临界二氧化碳流体技术在肺部给药用高分子多孔微球的制备方面具有较明显的优势，有望得到进一步的发展。

2 肺部给药载体多孔微球的改性方法

2.1 共混改性

共混改性包括物理共混和化学共混，其中物理共混是指在聚合物基质中混入黏性添加剂，与聚合物基质均匀混合共同固化成球，从而改性多孔微球的振实密度以及空气动力学性质，还可防止载药过程中药物的泄露，提高多孔微球的载药量和包封率，调节药物的释放速率。

Yoo等[37]采用W/O/W法在制备多孔微球的过程中混入淀粉，结果表明，改性后多孔微球仍适合肺部给药，而药物的释放由无淀粉的 2h延长到 5天，肺部沉积时间达20天。Kwon等[12]则在微球中共混二乙酰蔗糖六异丁酸酯，药物可达长效释放。化学共混是指在物理共混的基础上，应用静电络合原理，使药物和微球基质静电络合在一起，提高微球的载药量和包封率，最终调节药物的释放速率。Lee等分别用带负电荷的透明质酸[13]和软骨素硫酸盐[38]为黏性添加剂改性多孔微球，吸附带正电的LSZ，结果表明多孔微球仍可到达肺深层上皮细胞；而且药物缓释效果显著，表现为零级释药动力学特征。

2.2 共聚改性

图3 CO2抗溶剂法制得的PLLA多孔微球的扫描电镜照片及放大后的表面形貌[35]

单聚物的生物降解行为或物理化学性质往往不理想，故将其单体与其他的聚合物单体共价聚合，从而提高聚合物的特定性能，使其生物降解性和生物相容性更好。如PLGA即PLLA与PGA共聚而成，其性能变化和组成不是简单的线性关系，若组成各为50%的共聚物分子，各种性能出现转折，相比均聚物而言，降解速度最快，可溶于一般的有机溶剂，所以调节二者比例可以制备出不同的药物载体[38]。

Patel等[40]在多孔微球包载的药物模型是小分子量肝素，因其高度溶于水，故用亲水片段聚乙烯醇（PEG）来聚合改性疏水的 PLGA，结果表明，由于在溶剂挥发过程中二者在油水界面的分布不同，共聚物制备的微球表面呈海绵状多孔，PEG-PLGA微球孔洞效果较好，药物包封率和载药量较高，缓释效果明显，无突释现象。Baimark等[41]制备了甲基 PEG-PCL-PLA（PLA是聚乳酸）多孔微球，微球呈开放式多孔，内部孔道相互贯通，空气动力学性质较好，符合肺部给药要求。

2.3 分子修饰改性

作为“多孔微球药物载体的改性”的衍生技术，此方法是对药物分子进行适当的物理处理或化学修饰，使改性后的药物分子和聚合物基质亲和性更强，以提高微球的载药量和包封率。Lee等[42]采用S/W/O/W法，先将药物蛋白进行冷冻干燥，然后乳化制备载药微球，结果表明蛋白质的生物活性稳定而且可以从微球中长效释放。

化学修饰是综合化学合成与载体制备的一种前沿性技术，如图4所示，Kim等[24]将唾液素-4（Ex4）共价结合棕榈酰基基团（C16），通过吸附法载入多孔PLGA微球，载药量有所提高，这是因为C16较强的疏水作用易使 Ex4-C16吸附在微球的内部及表面；Ex4-C16比未修饰的Ex-4表现出更持久的的降血糖效果，分析原因有：①疏水作用加强了缓释；②血液白蛋白可与 C16非共价结合，保证了较高的血药浓度。随后，该课题组在此基础上又进行了改进，首先制备了载有白蛋白的多孔微球，然后再载入 Ex4-C16，药物缓释时间由之前的 5天延长到 7天[43]。因此，发挥肺部给药的优势将会为糖尿病等的治疗提供有利条件。

图4 多孔微球的分子修饰改性

2.4 药物共载

药物共载同样作为“多孔微球药物载体的改性”的衍生技术之一，逐渐成为研究热点。药物共载包括：药物与关键蛋白质共载、药物与基因共载。药物与关键蛋白质共同载入多孔微球，关键蛋白启动细胞信号转导，与药物起协同增效的作用。如肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（TRAIL）可激活细胞凋亡，该途径只在癌细胞表达，其靶向治疗非小细胞肺癌正在早期的临床研究阶段[44-45]。TRAIL与化疗药物阿霉素（DOX）等的联合治疗降低了化疗药物的使用量，减少了毒副作用[46-47]。Kim等[48]将其用于肺部给药（图5），采用W/O/W法制备了DOX-PLGA多孔微球，因PLGA中共混带负电荷的聚甲基丙烯酸乙酯（PEMA），故用吸附法吸附带正电的TRAIL。结果表明，DOX/TRAIL的载药量分别为86.5%、91.8%，从微球的释放分别为7 天和3天；TRAIL的加入降低了DOX的IC50，抑瘤效果显著。

图5 多孔微球的关键蛋白和药物共载

Lam等[49]综述了近几年利用 siRNA治疗肺部疾病的概况，指出该项研究最大的问题就是如何防止siRNA被酶解或清除，如何保持有效的肺部传递和沉积。然而目前有关可吸入siRNA治疗肺部疾病的研究很少，基因与化疗药物共载研究多集中于以阳离子脂质体为载体[50]的研究，所以将其用在可吸入多孔微球将是一个非常值得挖掘的领域，还有待进一步探索。

3 结 语

目前，肺部给药用高分子载体从简单的单聚合物到共混、共聚改性的聚合体，从单载药物到共载两种药物，已取得了很大的进展，但是还有一些问题需要更深一步的研究。首先，对肺部给药剂型的开发还需要进一步优化，首先如何对多孔微球的粒径和孔径进行单独操控，使其既能有效包埋药物，又具有良好的空气动力学性能；其次，若包载的药物为蛋白质，则其在肺部乃至全身传递过程中必须保持活力，由于蛋白质的构象问题以及特殊的酶解反应，其常常比小分子药物更难发挥药效，还有雾化吸入过程中药物的渗漏、肺部环境中囊泡的稳定性、药物在体内药动学的改变等。此外，近年来肺部给药已广泛地开展动物实验，但临床试验的研究还相对较少，药物载体释药后的降解性和安全性还需要得到进一步的保证。在多孔微球的制备方面，各种制备方法需互相结合，发挥各自的优势，如乳化法与超临界技术、静电喷射技术结合，相分离法与静电喷射技术结合，可能会制备出分散性更好，孔洞更均匀，粒径分布更窄，更符合肺部给药的多孔微球；在多孔微球的改性方面，可以尝试物理改性和化学改性的结合，尤其是基因与化疗药物的共载已经是肿瘤靶向研究的热点，而现在有关多孔微球共载两种药物的研究却相对较少，故应综合药用高分子材料、药剂学等方面制备性能更加可控的多孔微球。

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