Atosiban及纳洛酮对缩宫素镇痛作用的影响

魏小洁，郭曲练，张艳峰

Atosiban及纳洛酮对缩宫素镇痛作用的影响

魏小洁1，郭曲练2，张艳峰2

目的观察atosiban和纳洛酮对缩宫素(oxytocin,OT)中枢痛觉调制作用的影响。方法雄性SD大鼠随机分为鞘内注射组和侧脑室注射组2个大组。每个大组又分为7个剂量组：生理盐水+OT组(C组)；atosiban+OT高、中、低剂量组；纳洛酮+ OT高、中、低剂量组。各组大鼠在切割给药后的10 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h进行机械性痛阈测定，检测其变化情况。结果鞘内和侧脑室内预注射atosiban大鼠在注射OT后各时间点痛阈均低于C组(P<0.05)；预注射纳洛酮大鼠注射中、低剂量OT后痛阈较C组大鼠降低(P<0.05)；预注射纳洛酮大鼠注射0.25 nmol OT后其痛阈与C组差异无统计学意义(P>0.05)。结论鞘内和侧脑室内预注射atosiban可以阻断OT的镇痛作用，纳洛酮部分阻断OT镇痛效应。

缩宫素;催产素受体;切割痛;阿片受体;atosiban;纳洛酮

缩宫素(oxytocin，OT)参与脊髓和脊髓上中枢的痛觉调制，能缓解多种类型的疼痛[1]。OT在外周和中枢的多种生物学效应主要是通过与OT受体(oxytocin receptor, OTR)结合而实现的。阿片类药物是临床使用最广泛的镇痛药物[2,3]。目前，OTR在OT镇痛效应中的作用及其与阿片类受体等其他受体途径的关系尚不明确。本研究拟通过分别预先阻断OTR和阿片受体，探讨OT镇痛作用的具体机制。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及主要设备 OT(美国Sigma公司生产)，Atosiban(深圳翰宇生物科技有限公司)，纳洛酮注射液(2 ml：0.4 mg，湖南康哲制药有限公司)，Von-Frey 纤维丝(美国Stolting公司)，PE-0503导管(O.D 0.5 mm，宁波安来软件科技有限公司)，江湾大鼠脑立体定位仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)。

1.2 实验动物及分组 雄性清洁级SD大鼠112只，体重220～250 g，由中南大学湘雅医学院动物实验中心提供，动物证书号X2003115968。大鼠随机分为鞘内注射和侧脑室注射两大组，每组56只，每个大组分7个剂量组，每组8只。剂量分组如下：(1)生理盐水+OT 0.05 nmol组(对照组，C组)；(2)atosiban l.0 nmol+OT 0.05 nmol组；(3)atosiban l.0 nmol+OT 0.1 nmol组；(4) atosiban l.0 nmol+OT 0.25 nmol组；(5) 纳洛酮0.5 μg +OT 0.05 nmol组；(6)纳洛酮0.5 μg +OT 0.1 nmol组；(7)纳洛酮0.5 μg +OT 0.25 nmol组。其中鞘内注射组总容量为10 μl，侧脑室注射总容量为5 μl，所有容积的稀释均用生理盐水。两大组大鼠均在切割痛模型制作前5 min注射药物，模型制作后即刻注射OT。

1.3 方法

1.3.1 大鼠腰段鞘内置管模型的建立 大鼠以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，取L5～6间隙切开皮肤约1 cm，钝性分离皮下组织，在L5棘突下部剪断部分棘突，沿椎间隙缓慢置入PE 0503导管(预先在导管前端2～3 cm处以3-0慕斯线轻扎两圈以便置管后的固定，以不阻塞管腔为宜)，向头端送入2 cm，至脊髓腰膨大段。将导管与竖脊肌和皮下筋膜缝扎固定，经皮下隧道将导管固定于颈部。单笼饲养3 d后经鞘内导管注射2%利多卡因20 μl来判断导管的位置，如注射后30 s内大鼠出现双后肢麻痹，并在3 min内恢复，说明置管成功。

1.3.2 大鼠侧脑室置管模型的建立 大鼠麻醉后取俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上，在头部做一个1.5 cm的纵切口，钝性分离皮下组织，用无菌棉球蘸3%过氧化氢轻轻擦拭大鼠颅骨表面，清晰显露前囟，参考大鼠脑立体定位图谱，选取侧脑室最为明显和宽大，且绕开运动皮质等重要结构的坐标点进行定位穿刺，本实验选的坐标点(以前囟为原点)为AP:0.92 mm，LR:1.2 mm，H :4.0 mm，用牙科钻在定位点处钻开颅骨，用22 G穿刺针做成的导管垂直刺入距颅骨表面4.0 mm的脑组织内，明胶海绵止血后用牙科水泥将导管固定在颅骨上，导管露出颅骨表面0.5 cm，将导管尖端烧闭。大鼠侧脑室置管3 d后可以进行下一步实验。

1.3.3 大鼠切割痛模型的建立 分别取侧脑室置管及鞘内置管成功大鼠，依照Brennan 1996年介绍的方法，建立大鼠后足切割痛模型，即大鼠以2%异氟烷吸入麻醉后，俯卧位暴露右侧足底掌面，消毒后在距离足跟部0.5 cm处用10号刀片沿足跟至足趾方向纵行切开1 cm的皮肤和筋膜，切口在掌面正中，挑起跖肌并将跖肌从中间纵行分离，保持跖肌两端完整，无菌棉球轻压止血后用4-0丝线缝合切口。

1.3.4 一般行为学观察 鞘内置管和侧脑室置管术后每天观察大鼠活动度、摄食饮水情况、步态、切口处皮肤以及肌张力、运动能力，有否异常行为情况等。

1.3.5 机械性触诱发痛行为学的测定 用不同强度的Von Frey filaments纤毛，以从下到上、从小到大的顺序依次垂直刺激大鼠损伤足爪的预测定部位，使其纤毛轻度弯曲成S形，并保持5 s左右，观察其损伤侧后肢缩腿反射，大鼠在刺激时间内或在移开Von Frey filaments时立即出现快速的缩足反射，记为阳性反应。若大鼠没有出现此阳性反应，则选择其上一级的一个较大刻度的纤毛刺激足底部。依上述方法判断若出现阳性反应，则继续选择其下的一个较小刻度的纤毛刺激，依此类推。每个号码的纤毛刺激5次，每次间隔5 s，不同号码间隔10 s，直至找到引起大鼠5次刺激，至少有连续3次引起大鼠明显的缩腿反射但不是跳跃性的反射，则该纤维丝探针的压力值为大鼠损伤侧后肢机械刺激缩足阈值(paw withdrawal threshold，PWT)。同时可找到诱发缩腿反射或无缩腿反应相邻的两个刺激强度后，继续依序刺激4次，包括前面的2次，共6次刺激。利用中位法算出50%机械刺激缩足阈值。

2 结 果

纳入实验组大鼠在鞘内置管、侧脑室置管后均未出现明显的运动及感觉功能受损表现，给药后未出现不良反应。各组大鼠在切割痛模型制作前5 min鞘内预注射总容量均为5 μl的生理盐水或atosiban 1 nmol，切割痛模型制作后即刻鞘内给予0.05 nmol、0.1 nmol或0.25 nmol的OT，然后在各时间点测量机械性痛阈。痛阈测定结果表明，给予atosiban的大鼠在鞘内注射OT后各时间点痛阈均明显低于生理盐水对照组(P<0.05)。侧脑室内预注射atosiban组大鼠痛阈变化结果与鞘内注射组大鼠相似，给予atosiban的大鼠在鞘内注射OT后各时间点痛阈均低于生理盐水对照组(P<0.05)。各组大鼠在切割痛模型制作前5 min鞘内预注射总容量均为5 μl的生理盐水或0.5μg纳洛酮，切割痛模型制作后即刻鞘内给予0.05 nmol、0.1 nmol或0.25 nmol的OT，然后在各时间点测量机械性痛阈。本研究发现，预注射纳洛酮大鼠注射中、低剂量OT后痛阈较C组大鼠降低(P<0.05)；预注射纳洛酮大鼠注射0.25 nmolOT后其痛阈与C组差异无统计学意义。侧脑室内纳洛酮预注射结果与鞘内注射结果相符。见表1。

表1 大鼠鞘内和侧脑室置管后不同时间点对缩宫素镇痛作用的影响 (n=8；±s )

注：对照组为生理盐水组，A1、A2 、A3 表示1.0 nmol Atosiban分别对0.05、0.10、0.25 nmol缩宫素，N1、N2、N3表示0.5 μg纳络酮对0.05、0.10、0.25 nmol缩宫素；与对照组比较，①P<0.05

3 讨 论

OT在外周和中枢的多种生物学效应均是通过 OTR结合而实现的。OTR与精氨酸加压素(arginine vasopressin，AVP)受体在结构上高度同源，二者的作用部位也互有重叠[4]。因此，开发高度特异性的OTR激动药和拮抗药具有重要的意义。目前，应用比较普遍的OTR拮抗药是atosiban和OVTA，这两种物质均是小分子肽类。atosiban在临床上主要用于早产的治疗。同时，因其对OT的拮抗效果确切， atosiban在科研中应用较多。因此，本研究选用atosiban观察OT在中枢的痛觉调制作用。

本研究发现，鞘内或脑室内注射atosiban均可以拮抗OT的镇痛作用。Han等[5]证实，在杏仁中央核局部注射OT可以使大鼠对机械伤害性刺激和热伤害性刺激的缩足潜伏期延长，而事先在该部位注射其受体阻断药atosiban可以消除这一作用。这说明OT在杏仁中央核的镇痛作用是通过与OTR作用发挥的。在炎性痛大鼠鞘内注射atosiban同样可以抵消OT对炎性痛的镇痛作用，单独鞘内注射atosiban可以使炎性痛大鼠痛敏增加[6]。但切割痛的疼痛发生和维持机制与炎性痛和生理性抗伤害反应均不同，在切割痛中OTR是否发挥了重要作用还不清楚。OT 的镇痛效应可能是OT与OTR作用后直接或间接使得膜电位的变化减小，阻断了NMDA受体的激活。Breton等[7]的研究显示，下丘脑视旁核释放的OT能够激活板层Ⅱ内的谷氨酸能神经元，激活的谷氨酸能神经元会进一步活化脊髓Ⅰ、Ⅱ板层内的GABA能神经元，进而起到广泛的抑制作用。

本实验结果表明，鞘内和侧脑室内注射atosiban均可以阻断OT对切割痛的镇痛作用，使注射OT后的痛阈明显低于生理盐水对照组，且在一定范围内加大OT的剂量并不能消除atosiban的阻断作用，这可能是由于atosiban与OT起到的是非竞争性拮抗作用，或者atosiban与OTR的结合能力远远大于OT，使得OT很难竞争性从OTR上置换下atosiban，这显示了atosiban的强大效能。

阿片类药物是目前临床应用最广泛的镇痛药物，但其可能导致便秘、呼吸抑制及成瘾等诸多并发症。因此，寻找理想的镇痛药物仍然是研究的热点[8]。OTR是G蛋白偶联受体家族成员，在与OT结合之后其构象发生改变，将信号传入胞内第二信使，一方面可以使神经元的兴奋性改变从而产生即时反应，另一方面也可以通过改变细胞内基因表达而产生长时程反应。阿片受体在中枢神经系统分布广泛，免疫组化和原位杂交证实其分布与OTR分布有很多相同，且二者均为G蛋白偶联受体，配体均参与多种形式的痛觉调制，这些都强烈提示OT作用部位可能与阿片受体有关[9]。而阿片受体是否参与OT相关的切割痛镇痛效应尚无研究。纳洛酮能竞争性的拮抗阿片类受体，能逆转阿片受体激动剂的效应[10]。本实验结果显示，在侧脑室和鞘内注射纳洛酮能够一定程度地降低OT的镇痛作用，而随着OT剂量的加大，纳洛酮的阻断作用相对减轻，这说明OT的镇痛作用与阿片系统有关但又不完全依赖于阿片系统，而主要是通过OTR起到的。OT作用的这一特点为临床在中枢神经系统中勾画出一个相对独立的切割痛痛觉调制网络，这个网络的上游或者下游通路可能对中枢感知痛觉起到重要作用，而这有待进一步的研究。

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(2013-12-25收稿 2014-02-21修回)

(责任编辑 郭 青)

Roleofatosibanandnaloxoneinanalgesiceffectsofoxytocin

WEI Xiaojie1, GUO Qulian2,and ZHANG Yanfeng2.1.Department of Anesthesiology, Hunan Provincial Corps Hospital,Chinese People’s Armed Police Forces, Changsha 410006,China;2.Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008，China

ObjectiveTo study the role of atosiban and naloxone in the analgesic effects of oxytocin (OT).MethodsMale SD rats were divided randomly into 2 groups, i.th group and i.c.v group. And both groups subdivided as below: N.S+OT (control group, C)；atosiban + OT low, medium and high dose groups；naloxone + OT low, medium and high dose groups. And the mechanical pain threshold was tested 10 min，30 min，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h after incision in all of the rats.ResultsI.th and i.c.v administration of atosiban could thoroughly inhibit the analgesia effect of OT(P<0.05); compared with control group, the pain threshold of rats with naloxone only decreased after low and medium doses of OT(P<0.05); the pain threshold had no significant differences between the high dose OT treated rats and the control group(P>0.05).ConclusionsThe analgesic effect of OT can be totally inhibited by i.t.h or i.c.v atosiban, but partly depressed by naloxone.

oxytocin; oxytocin receptor; incisional pain; opioid receptor; atosiban; naloxone

魏小洁，博士，副主任医师，E-mail：weixiaojie5@126.com

1.410006长沙，武警湖南总队医院麻醉科；2.410008长沙，中南大学湘雅医院麻醉科

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