epiregulin 在涎腺腺样囊性癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

郭 晓，葛兮源，王衣祥，傅 嘉，李盛林，3

epiregulin在涎腺腺样囊性癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

郭 晓1，2，葛兮源1，3，王衣祥1，3，傅 嘉1，3，李盛林1，2，3

目的探讨表皮生长因子epiregulin在涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)肺转移中的作用。方法SACC石蜡组织标本30例。通过免疫组织化学方法(SP方法)检测epiregulin 在SACC石蜡组织标本中的表达，并分析其与临床病理特征之间的关系。结果(1)Epiregulin广泛地表达于细胞质或细胞核。(2)SACC发生肺转移15例，阳性着色率86.7%(13/15)，H-score(Hs)定量分析平均为1.26±0.65；未发生肺转移15例，阳性着色率33.3%(5/15)，Hs为0.48±0.25。与Ⅰ+Ⅱ期相比，epiregulin在SACC Ⅲ+Ⅳ期表达显著升高。(3)Kaplan-Miere 生存曲线分析未发现epiregulin的表达与SACC患者的预后相关。结论Epiregulin的表达与涎腺腺样囊性癌肺转移有一定相关性，但仍需要大样本研究进一步证明。

涎腺腺样囊性癌；肺转移；表皮调节素

涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是发生在大小唾液腺中最常见的恶性肿瘤之一，在所有唾液腺恶性肿瘤中占22%～24%[1-3]。其生物学行为特殊，嗜神经侵袭性强，易发生血行转移，远处转移率可高达40%[4, 5]，肺是最主要的转移部位。尽管SACC短期预后好，但其远期生存率较差。远处转移是主要死亡原因之一。epiregulin是表皮生长因子家族的成员之一。有研究发现，epiregulin在一些类型的肿瘤组织中高表达，如大肠癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和人口腔鳞状细胞癌[6-14]。前期affymetrix U133人类基因芯片的研究发现，与SACC低肺转移潜能细胞系SACC-83细胞相比，epiregulin的mRNA表达水平在高肺转移潜能细胞系SACC-LM细胞中上调了4.55倍[15]。 此外，外源性的epiregulin可以促进SACC-83细胞的体外迁移和侵袭能力[15]。但是，epiregulin在涎腺腺样囊性癌组织中的表达及其与肺转移的关系还不清楚。本研究旨在探讨epiregulin的表达与SACC肺转移及其他临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 病例及组织标本 选取2001-01至2003-12在北京大学口腔医院颌面外科就诊并诊断为SACC 30例，男12例，女18例。随访结束于2013-05-04，之后对临床资料进行回顾性整理和分析。发病年龄17～70岁，中位年龄40.75岁，平均随访期限102.9个月。由高年资病理医师按照国际抗癌联盟(UICC)的TNM方法(2002版本)对患者的病理诊断进行确认。X线片检查明确是否发生肺转移。在本研究设立的随访时限内，若观察到肺转移，则定义为肺转移组(15例)；若未观察到肺转移，则定义为未转移组(15例)。

1.2 免疫组织化学及半定量评估 组织切片(4 μm 厚)在二甲苯中脱蜡，75%乙醇中水化。切片在0.01 M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原热修复，3%过氧化氢处理去除内源性过氧化物酶活性，孵育10%胎牛血清阻止非特异性结合。组织切片PBS漂洗，加epiregulin (1∶200, R&D systems, Minneapolis, MN, USA) 一抗4 ℃孵育过夜，IgG为对照。随后孵育生物素标记后的二抗(中衫金桥生物技术有限公司，北京)。苏木精复染，二氨基联苯胺(DAB)镜下显色。通过H-score(Hs)对染色强度进行半定量分析，Hs=∑(Pi×i)/100, Pi是着色细胞的百分比(胞核或胞质)，i是着色强度 (0、1、2或3)。评分选取40×高倍镜下随机3个视野，由两个评分人独立评分。设置Hs=0.5为临界点[16]，将epiregulin的半定量表达转换成二分类变量，即低表达组(Hs≤0.5)及高表达组(Hs>0.5)，比较两组的预后。

2 结 果

2.1 epiregulin的表达 30例中，有18例epiregulin的表达呈阳性，表达率为60.0%，主要在细胞核或细胞质中表达(图1)。其中，Epiregulin在转移组中的阳性着色率为86.7%(13/15)，在未转移组中为33.3%(5/15)。转移组epiregulin平均Hs为1.26±0.65，未转移组Hs为0.48±0.25，两组间差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 人涎腺腺样囊性癌组织epiregulin的表达 (DAB染色，×40)

2.2 epiregulin的表达与临床病理特征之间的关系 epiregulin表达与年龄、部位、组织分型、周围神经浸润等临床病理特征无统计学关联，而与性别、肺转移和临床分期有统计学关联(表1)。

2.3 epiregulin的表达与预后的关系 Kaplan-Miere生存曲线(图2)及Log-Rank检验未发现epiregulin的表达与患者的生存期相关(P=0.336)。

3 讨 论

3.1 epiregulin表达与人类肿瘤 SACC是以远处转移为特征的涎腺恶性肿瘤，以肺部转移为主。肿瘤转移机制尽管研究的很广泛，如从表观遗传学的角度[17]、紧密连接的角度[18]及MicroRNA的角度[19]等，但其发病机制仍然不详。寻找能够预测SACC转移的生物标志物将有助于提高患者生存率。epiregulin在健康人组织中表达极低，主要在外周血巨噬细胞和胎盘组织中。而在人的一些肿瘤组织中epiregulin的表达增高，且与肿瘤的生物学特性相关，如膀胱癌、非小细胞肺癌、肺癌、大肠癌等，成为人们探讨肿瘤生物标志物的热点。Zhang等[12]报道，在人非小细胞肺癌中epiregulin主要表达于细胞质，而Sunaga与Sun等[13，20]报道在人非小细胞肺癌组织中细胞核与细胞质均有表达。本研究首次明确了在人的涎腺腺样囊性癌组织中，epiregulin广泛地表达于细胞核或细胞质。

表1 epiregulin 在SACC组织中的表达及其与临床病理特征的关系 ±s)

图2 epiregulin的Keplan-Miere生存分析曲线Log-Rank检验未发现两组有生存差异,P=0.479

3.2 epiregulin的表达与转移的关系 在人大肠癌的研究中[21]，epiregulin的表达与肿瘤浸润的深度及远处转移相关；在人非小细胞肺癌中[12]，epiregulin高表达与淋巴结转移及缩短的生存时间相关，且可以作为肺腺癌的独立预后指标[13]。在小鼠的乳腺癌细胞实验模型中，Ereg基因(编码epiregulin)被发现能与Cox2，Mmp1和Mmp2协同促进肿瘤生长、血管生长和肺转移[22]。目前积累的证据提示epiregulin在一些肿瘤中具有促进迁徙和侵袭的作用。在本研究中，肺转移组的组织标本中epiregulin的表达明显高于未转移组，且epiregulin高表达与肺转移相关，提示epiregulin可能在SACC肺转移过程中发挥作用。

3.3 epiregulin的表达与临床分期和患者生存的关系 Thøgersen等[8]的研究提示，epiregulin mRNA的表达水平在T2到T4期膀胱癌肿瘤组织中显著高于Ta期(肿瘤局限在膀胱的内衬上皮层)，而且其高表达与患者的生存紧密相关。但在本研究中，只发现临床Ⅲ+Ⅳ期患者epiregulin表达高于Ⅰ+Ⅱ期，却未发现epiregulin的表达与患者的生存时间相关。其原因可能与SACC组织的多形性有关，或者还需要寻找更多的相关指标联合进行预后相关性判断。Sunaga等[13]报道，在非小细胞肺癌中，epiregulin高表达组的生存时间与epiregulin低表达组的生存时间差异呈弱阳性(P=0.058)。当将epiregulin表达与KRAS突变联合分析时发现，epiregulin高表达且KRAS突变组的生存时间与epiregulin低表达且KRAS野生型组有统计学差异。另外，本研究的样本量可能不具有优势。因此，扩大研究样本量以进一步验证上述研究结果十分必要。

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(2013-12-20收稿 2014-03-06修回)

(责任编辑 武建虎)

Expressionofepiregulinintissueofsalivaryadenoidcysticcarcinomaanditsrelationshipwithclinicopathologicalcharacteristics

GUO Xiao1，2, GE Xiyuan1，3, WANG Yixiang1，3, FU Jia1，3, and LI Shenglin1，2，3. 1. Central Laboratory，2. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, 3. Laboratory of Oral and Maxillofacial Surgery, Peking University School and Hospital of Stomatology, Beijing 100081，China

ObjectiveTo study the role of epiregulin, a member of epidermal growth factor (EGF) family, in the metastasis of salivary adenoid cystic carcinoma (SACC) cell.MethodsThirty paraffin-embeded archival tissue samples were used to examine epiregulin expression in SACC tissue by immunohistochemistry SP methods. Its relationship with clinicopathological characteristics were analyzed afterwards.Results(1)Epiregulin expressed broadly in cytoplasm or nuclear compartments. (2)The epiregulin positive stain rate in lung metastasis-group (15 cases) was 86.7%(13/15), its average H-score is 1.26±0.65, whereas for non-metastasis group, the positive stain rate was 33.3%(5/15), and H-score was 0.48±0.25 on average. Epiregulin expressed higher in stage Ⅲ and Ⅳ than in clinical stages of Ⅰand Ⅱ. (3)No correlation was found between epiregulin expression and survival.ConclusionsEpiregulin expression may be associated with SACC lung metastasis. Studies of large sample size to further confirm the findings of this pilot study is warranted.

salivary adenoid cystic carcinoma/SACC; lung metastasis;ereg/epiregulin

国家自然科学基金(81272967)

郭 晓，硕士研究生在读，E-mail:xjcarrie@sina.com

100081，北京大学口腔医院：1.中心实验室, 2.口腔颌面外科；3.100081，北京大学口腔医学院口腔颌面外科研究室

李盛林，E-mail:kqshlli@bjmu.edu.cn

R739.87