模拟高原缺氧对大鼠学习记忆的影响及脑组织病理改变

张艳超，李运明，贾玉英，张新颜，顾建文

·高原医学·

模拟高原缺氧对大鼠学习记忆的影响及脑组织病理改变

张艳超，李运明，贾玉英，张新颜，顾建文

目的 观察不同海拔高度对大鼠低压缺氧脑损伤的空间记忆的影响及脑组织病理改变。方法 120只Wistar大鼠，分为模拟海拔4000 m(n=30)、6000 m(n=30)、8000 m(n=30)及平原组(海拔500 m，n=30)，利用低压低氧动物实验舱模拟相应海拔高度，各组大鼠分别在各自模拟海拔高度舱内连续饲养3 d，观察大鼠生存状态；3 d后从舱内取出大鼠，各组随机抽取8只大鼠，在舱外利用Morris水迷宫图像自动采集处理系统，对大鼠进行寻找隐藏平台的平均逃避潜伏期(MEL)测试；同时，各组从剩余大鼠中随机抽取8只，从舱内取出后立即处死，断头取脑，采用干/湿比重法测定各组大鼠脑组织含水量的变化；采用苏木精-伊红染色法(HE)观察各组大鼠脑组织病理变化。结果 Morris水迷宫实验中，各模拟高原组MEL较平原组增加；不同高原组间比较，随海拔升高，MEL延长，差异显著(P<0.01)。各模拟高原组大鼠脑组织含水量均较平原组显著增加(P<0.05)，各高原组间比较，随海拔升高，脑组织含水量逐步上升，差异明显(P<0.05)；各高原缺氧组大鼠脑组织病理切片可见胶质细胞和周围血管水肿，且随海拔升高，水肿程度加重。结论 高原低压缺氧环境可导致大鼠脑水肿，进而造成大鼠学习记忆功能障碍。

高原；缺氧；脑水肿；学习记忆

随着国家对西部大开发政策的实施，平原人在高原地区的生活、工作等活动日益广泛。高原地势高，空气稀薄，当人们从平原进入高原地区时，伴随着机体摄氧不足和组织氧供的减少，大脑明显受损[1]，严重时可导致高原脑水肿。学习记忆功能是大脑最重要的高级神经功能之一，同时也是中枢神经系统功能的整合，长期暴露在低压缺氧环境会导致氧化应激和神经退行性疾病，导致记忆障碍[2]。本研究采用低压低氧动物实验舱模拟不同海拔高度制作高原缺氧脑损伤模型，利用Morris水迷宫实验对大鼠学习记忆功能进行观察，取脑组织做病理切片观察病理改变，探讨模拟高原缺氧脑水肿与大鼠学习记忆功能的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与分组 健康Wistar成年大鼠120只[四川大学动物房提供，使用许可证SYXK(川2009-045)]，雄性，体重(196.5±5.9)g。按大鼠体重编号后，采用SPSS软件产生的完全随机数字分为：4000 m、6000 m、8000 m 3个海拔高原组(n=30)，以及平原组(成都地区海拔约500 m，n=30)。

1.1.2 主要试剂及实验设备 低压低氧动物实验舱(贵州风雷航空军械有限责任公司，型号：FLYDWC50-1A)；Morris水迷宫图像自动采集处理系统(成都仪器厂，型号XMT614)；万分之一电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，型号：BSA223S]；电热恒温鼓风干燥箱；切片机。

1.2 实验方法

1.2.1 模拟高原低压低氧环境 将各组大鼠置于低压低氧动物实验舱内，分别模拟海拔4000 m、6000 m、8000 m高原环境，72 h不间断连续减压。舱内温度控制在25 ℃左右，期间大鼠自由摄食及饮水。平原对照组大鼠于舱外(成都地区海拔约500 m)同时饲养。 观察各组大鼠在此期间的生存状态。

1.2.2 空间记忆功能测试 缺氧72 h后从舱内取出大鼠，各组按SPSS软件产生的完全随机数字抽取8只，利用Morris水迷宫图像自动采集处理系统对大鼠进行行为学测试。先行1 d适应训练，将大鼠放入无平台的水池中游泳2 min，使其熟悉水池环境及适应水温，从第2 d开始，进行为期3 d的寻找水下隐匿平台训练，水池平均分为4个象限，右上象限为一象限，逆时针方向依次为第二、三、四象限。水池内放入清水(25±1)℃，平台置于水下1 cm处。本次实验中将平台放置于第一象限中部，将每只大鼠依次从一、二、三、四象限将大鼠面向桶壁放入水池，大鼠入水后寻找隐匿平台并在平台上停留5 s为该象限的逃避潜伏期(MEL)，然后开始下一象限实验，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的MEL及行程。每只大鼠每天训练4次，每个象限每天只用一次，每只大鼠每天4个象限的MEL平均值记录为当天的平均逃避潜伏期。

1.2.3 脑组织切片的制备及含水量测定 各组模拟不同海拔高度饲养72 h后，各组按SPSS软件产生的完全随机数字抽取8只大鼠，从舱内取出，立即处死，并快速断头取脑，矢状位对称切开全脑，去除小脑及脑干。切取右侧脑组织标本，常规固定、石蜡包埋，4 μm切片，裱于经多聚赖氨酸包被的清洁载玻片上，常规脱蜡、复水、PBS液洗涤，HE染色。取剩余左脑组织约0.7 g，准确称重后，放入恒温烘干箱100 ℃烘烤24 h至恒重后，称取干脑重(精确到0.01 g)，按Elliott公式计算：脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

2 结果

2.1 动物生存状态观察 各高原组均出现呼吸节律变化，表现为短暂的呼吸暂停，精神萎靡、行动迟缓、食欲差。3个高原组均发生了呼吸骤停、四肢抽搐及死亡，并且随着海拔的升高,上述症状逐步加重。平原组未发现呼吸骤停、四肢抽搐及死亡等情况。见表1。

表1 各组大鼠异常表现情况[n=30，例(%)]

注：与平原组比较，①P<0.01；与4000 m组比较，②P<0.01；与6000 m组比较，③P<0.01

2.2 空间记忆功能测试 Morris水迷宫测试中，第2～3 d与第1 d相比，各组大鼠寻找隐藏平台的MEL均缩短(P<0.01)；相同时间点，各高原组与平原组相比，MEL增加(P<0.01)，并随海拔升高，MEL延长(P<0.01，表2)，大鼠寻找逃逸平台的运动路线增加(图1)。

表2 各组大鼠Morris水迷宫MEL比较(n=8)

注：与第1 d比较，①P<0.01；与平原组比较，②P<0.01

2.3 脑组织病理学改变 大体观察：各高原组均可见脑皮层弥漫充血、脑水肿；镜下观察，高倍镜下，高原组均发现水肿神经元细胞，细胞及血管周围间隙增大，且随海拔升高，大脑毛细血管和神经细胞水肿程度逐渐加重。而平原组未见脑水肿，结构完整。见图2。

2.4 各组大鼠脑含水量测定 各高原组脑含水量较平原组显著增高(P<0.05)，且随海拔升高脑含水量增加(P<0.05，图3)。

图3 各组大鼠脑含水量比较

3 讨论

学习记忆功能是大脑最重要的高级神经功能之一，同时也是中枢神经系统功能的整合，高原地区随着海拔升高，大气压变低，氧含量减少，温度下降，湿度下降，紫外线辐射增加，可导致不同程度的颅脑损伤，从而引起学习记忆功能下降[3]，长期暴露在低压缺氧环境会引起氧化应激和神经退行性疾病，导致记忆障碍[4-5]。研究表明，大脑损伤后，近期记忆中的情节、记忆的过程与空间位置的学习都受到影响，大脑损伤将造成顺行性遗忘症[6]。

本研究Morris水迷宫实验检测结果显示，高原组寻找隐藏平台的行程和时间明显长于平原组，提示缺氧对分辨学习、防御条件反应的保持以及空间学习能力均有破坏，从而降低动物或患者学习新事物和新技巧的能力。本研究结果表明，随着海拔升高，大鼠寻找隐藏平台的MEL和行程增加，提示随着海拔升高，大鼠空间记忆功能下降，这与国外研究者结论一致[7-8]。

低压缺氧致脑损伤后可导致脑水肿，造成颅内压增高甚至导致脑疝，从而引起严重的病理损害，增加颅脑伤病死率和致残率[9]。本研究中，各模拟高原组脑组织干/湿比较平原组明显升高，且随着海拔升高，干/湿比增加，差异明显；镜下观察各组大鼠脑组织病理切片，发现各模拟高原组不同程度脑血管水肿和细胞水肿，且随着海拔升高，水肿程度加重，提示模拟高海拔低压缺氧环境可以导致大鼠脑水肿，这些结果与Morris水迷宫实验结果相互印证。

综上所述，模拟高海拔低压缺氧环境可导致大鼠脑水肿，进而造成大鼠学习记忆功能减退，且随海拔的升高，大鼠脑水肿程度加重，学习记忆功能下降越明显。由此推测，高原脑水肿可能是引起缺氧导致学习记忆功能下降的原因之一。本研究也存在不足，高原脑损伤引起细胞水肿对学习记忆功能的影响机制还需要深入研究。在下一步的实验中，考虑通过对脑组织的关键酶和介质活性的调控的研究，找出干预大鼠高原缺氧环境下脑水肿发生的方法，为高原脑损伤的治疗和预防寻找新的方式和作用靶点。

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Influence of simulated high attitude anoxia on rat's learning and memory and pathological changes of brain tissue

Zhang Yanchao,Li Yunming,Zhang Xinyan,Gu Jianwen

Department of Neurosurgery,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To observe the influence of simulated different high altitude anoxia on rat's space memory under low pressure and anoxia condition as well as the pathologic change of brain tissue.Methods 120 Wistar rats were randomly divided into 4 groups: 4000 m group(n=30),6000 m group(n=30),8000 m group(n=30)and plain group(n=30).The rats in each of the first 3 groups were fed in the stimulated chambers of their fixed altitude for 3 days,while the rats in plain group were fed outside the chamber.8 rats were selected from each group and the mean escape latency(MEL)for the invisible platforms in Morris water maze automatic image collection system was recorded.Other 8 rats in each of the group fed in the chamber,as soon as they were taken out of the chamber,were killed as well as other 8 rats in plain group.Their brain tissues were taken out and the changes of water content were detected by dry weight method. HE stain method was applied to observe the pathological changes of the brain tissue.Results The Morris water maze analysis showed that the MEL in the 3 stimulated groups was longer than that in plain group(P<0.05);MEL got longer with the increase of altitude and the difference among the 3 stimulated groups was obvious(P<0.05).The same change of water content of the brain tissues was observed among the 3 stimulated groups(P<0.05)as MEL.Glial cells and peripheral vascular edema got worse with the increase of the altitude.Conclusions Low pressure and anoxia at high altitude may lead to brain edema of the rats and result in learning and memory block.

high altitude;anoxia;brain edema;learning and memory

国家自然科学基金(81000859)

610083 成都，成都军区总医院神经外科(张艳超，李运明，张新颜，顾建文)；成都军区联勤部第二门诊部保健科(贾玉英)

顾建文，E-mail: 2914081083@qq.com

R 594.3/651.25

A

1004-0188(2014)04-0432-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.04.034

2014-01-20)