T细胞斑点实验与结核杆菌DNA检测对肠结核的诊断价值

赵纯成,周 钢,李远洪,张 林

T细胞斑点实验与结核杆菌DNA检测对肠结核的诊断价值

赵纯成,周 钢,李远洪,张 林

目的 探讨结核杆菌T细胞斑点实验(T-spot-TB)与结核杆菌DNA检测在肠结核诊断中的应用价值。方法 对2009年6月～2013年4月我科行T-spot-TB与结核杆菌DNA检测的可疑肠结核患者128例进行回顾性分析,其中确诊肠结核72例,非肠结核56例。对比分析两种方法诊断肠结核的灵敏度及特异度。结果 T-spot-TB诊断肠结核灵敏度为90.3%,特异性为91.1%；结核杆菌DNA检测灵敏度为73.6%,特异性为100.0%。T-spot-TB诊断肠结核灵敏度高于DNA检测,但其特异性低于DNA检测；两种方法检测阳性率在不同病理表现的肠结核患者中无显著差异。两种方法同时检测的阳性预测值及阴性预测值均为100%。结论 T-spot-TB与结核杆菌DNA联合检测有助于提高肠结核诊断的灵敏度和特异度。

肠结核；结核杆菌；T细胞；斑点实验；DNA检测；诊断

随着结核感染在全球范围内的死灰复燃,目前结核的发病率呈升高趋势。肠结核是结核分枝杆菌侵犯肠黏膜引起的肠道特异性感染,部分肠结核与克罗恩病、溃疡型结肠炎及其他非特异性肠道炎症有相似的临床特征,缺乏特异性表现,鉴别诊断非常困难[1-2]。结核T细胞斑点试验(T-spot-TB)通过检测结核感染后T细胞分泌的特异性γ-干扰素来诊断是否存在结核感染,对结核诊断的特异性和敏感性较高[3-4],有助于肠结核的诊断和鉴别诊断[5]。结核杆菌DNA检测提高了结核诊断的特异性[6],有助于肠结核与克罗恩病的鉴别[7-8]。有关两种方法应用于肠结核的诊断和鉴别诊断的对比分析,目前国内外报道少见。本研究对比分析了T-spot-TB与结核杆菌DNA检测在诊断肠结核中的价值,为肠结核的诊断及鉴别诊断方法的选择提供参考。

1 资料与方法

1.1 病例资料 对2009年6月～2013年4月我科行T-spot-TB与结核杆菌DNA检测的可疑肠结核患者128例进行回顾性分析。其中男性86例,女性42例,年龄16～72(36.3±24.2)岁；最终确诊肠结核72例,非肠结核56例(包括克罗恩病32例,肠淋巴瘤10例,结肠癌6例,溃疡性结肠炎4例,肠息肉或腺瘤4例)。肠结核的最终诊断依据临床表现、肠镜下表现、病理学检查发现干酪样肉芽肿、抗酸染色阳性、抗结核实验性治疗有效等；克罗恩病及溃疡性结肠炎诊断符合2008年中华医学会制定的炎症性肠病诊断标准[9]；肠淋巴瘤、肠息肉或腺瘤均由病理学检查确诊。

1.2 T-spot-TB检测 采用英国Oxford Immunoter公司提供的试剂盒进行检测,标本为抗凝外周静脉血4 ml。首先采用密度梯度离心法分离、收集外周血单个核细胞,制备细胞悬液。T-spot检测按照试剂盒操作说明书进行。设置阳性对照孔、阴性对照孔、A和B检测孔,各孔均包被IFN-γ抗体,分别加入阳性对照物、阴性对照物、结核杆菌特异性抗原A和B。按照试剂盒说明书,每孔加入(2.0～3.0)×105个单个核细胞,37 ℃、5%CO2培养箱中孵育16～20 h。然后经洗脱后加入碱性磷酸酶标记的抗IFN-γ抗体,4 ℃孵育2 h,PBS洗脱,显色,显微镜下计数斑点数。阳性判断标准：若阴性对照组斑点数<6个,测试孔斑点数多于阴性孔6个以上为阳性；若阴性对照孔斑点数≥6个,测试孔斑点数为阴性对照孔2倍或2倍以上为阳性。

1.3 结核杆菌DNA检测 采用聚合酶链反应(PCR)技术检测患者肠黏膜组织中结核杆菌DNA的表达。PCR试剂盒购自科华公司,仪器采用 Roche公司生产的LightCycler荧光定量分析仪。肠镜下活检钳取可疑病变组织1块,立即置于Eppendorf管中,加入DNA提取液50 μl,混匀后,100 ℃沸水浴10 min,10 000 r/min离心5 min,提取上清液进行DNA扩增。按照试剂盒操作说明书进行,设置阴性对照、阳性对照,按照文献[8]引物序列、反应条件及循环参数进行PCR反应。扩增片段长度123 bp,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,如出现目标条带则为阳性。

表1 128例患者T-spot-TB及结核杆菌DNA检测情况[n(%)]

注：与对照组相比,①P<0.05

1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件分析,2×2列表计算检测方法的灵敏度、特异度,统计检测指标阳性率,进行χ2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法检测灵敏度和特异度 T-spot-TB检测发现72例肠结核患者中,阳性65例,阴性7例,检测肠结核灵敏度为90.3%,假阴性率为9.7%；56例非肠结核患者中,阳性5例,阴性51例,诊断肠结核特异性为91.1%,假阳性率为8.9%。结核杆菌DNA检测发现72例肠结核患者中,阳性53例,阴性19例,灵敏度为73.6%,假阴性率为26.4%；非肠结核患者中,阳性0例,阴性56例,特异性为100.0%,假阳性率为0.0%。T-spot-TB诊断肠结核灵敏度高于DNA检测,但其特异性低于DNA检测。见表1。

2.2 两种检测方法对肠结核不同病理表现的检测结果 72例肠结核患者中,肉芽肿(-)者28例,其中T-spot-TB阳性率为85.7%,DNA阳性率为71.4%。肉芽肿患者44例,其中发现干酪样坏死11例,其余33例未见干酪样坏死。11例干酪样坏死患者中,T-spot-TB阳性率为100.0%,DNA阳性率为81.8%；33例干酪样坏死阴性患者中,T-spot-TB阳性率为90.9%,DNA阳性率为72.7%。两种方法检测阳性率在不同病理表现的肠结核患者中无显著差异。见表2。

表2 不同病理表现肠结核患者T-spot-TB及结核杆菌DNA检测结果[n(%)]

2.3 两种方法联合检测结果 两种方法均阳性患者50例,最终均证实均为肠结核,阳性预测值为100%；两种方法均阴性患者42例,均证实为非肠结核,阴性预测值为100%。两种方法联合检测肠结核的敏感度为69.4%,特异性为100%。见表3。

表3 两种方法联合检测结果(肠结核阳性例数)

3 讨论

传统的结核诊断方法包括结核菌素实验、抗酸染色、结核杆菌培养等,存在灵敏度差、耗时长、特异性差等不足,尚不足以满足临床诊断的需要。近年来,T-spot-TB及结核杆菌DNA检测技术的应用增加了肠结核诊断的灵敏度和特异度,史笑梅等[10]报道,T-spot-TB诊断肠结核的灵敏度为92.0%,特异度为92.3%。邱志兵等[11]报道,T-spot-TB检测肠结核灵敏度为92.3%,特异度为77.5%。而结核菌素实验诊断活动性肠结核灵敏度为53.85%,特异度为85%。雷少妮等[5]报道,T-spot-TB检测肠结核的灵敏度和特异度分别为85.7%与93.3%。本组资料显示,T-spot-TB检测肠结核的灵敏度为90.3%,特异度为91.1%,与上述报道基本相符。

随着PCR技术的不断进展,结核杆菌DNA的检测目前已广泛应用于临床结核的诊断。通过特异性体外扩增结核杆菌DNA片段达到诊断的目的,提高了诊断的灵敏度,较结核杆菌培养耗时明显缩短。陈瑜君等[12]检测结肠石蜡包埋标本中结核杆菌DNA诊断肠结核灵明度为32.0%,特异度为100.0%。顾清等[7]通过检测石蜡包埋及新鲜肠黏膜标本中结核杆菌DNA的表达,结果发现其灵敏度为63.89%,特异度为83.33%。本组资料均为新鲜肠黏膜标本,结核杆菌DNA检测灵敏度为73.6%,特异度为100%。本组灵敏度高于上述报道,可能是所取标本为新鲜肠黏膜组织,减少了DNA的降解,保证了检测的灵敏度。

本研究还发现,两种方法检测在是否存在肉芽肿或是否检出干酪样坏死的患者中,阳性率并无显著差异,可见这两种检测方法不受肠结核病理类型的影响。两者相比,T-spot-TB的灵敏度高于DNA检测,但其特异度低于DNA检测。而两者同时阳性的特异性为100%,阴性预测率为100%。

[1] 黄鑫,廖旺娣,朱萱.回结肠克罗恩病与肠结核鉴别诊断研究进展[J].中国实用内科杂志,2013,33(4):318-321.

[2] 王晓兵,程梦馨,夏冰.肠结核与克罗恩病鉴别诊断的临床评价[J].临床内科杂志,2012,29(11):728-731.

[3] 王永生,刘蔺,周航,等.结核感染T细胞斑点试验在结核诊断中的应用[J].四川医学,2013(1):10-12.

[4] 谢希,陈进伟,高洁生,等.结核感染T细胞斑点试验在结核诊断中的应用[J].临床内科杂志,2010(6):396-399.

[5] 雷少妮,刘家云,梁洁,等.结核杆菌T细胞斑点试验在克罗恩病与肠结核鉴别诊断中的应用价值[J].中华消化杂志,2011,31(10):677-680.

[6] 邵俊斌,王占坤,陈智,等.实时荧光定量聚合酶链反应法检测痰结核杆菌DNA及其临床应用[J].中华结核和呼吸杂志,2003,26(8):490.

[7] 顾清,欧阳钦,夏庆杰.FQ-PCR检测肠黏膜结核杆菌DNA对肠结核的诊断价值[J].中国实验诊断学,2009,13(6):741-744.

[8] 甘华田,欧阳钦.结核杆菌DNA检测在肠结核与克罗恩病鉴别诊断中的价值[J].中华消化杂志,2001,21(4):215-218.

[9] 中华医学会消化病学分会.中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[J].中华内科杂志,2008(1):73-79.

[10] 史笑梅,褚燕君,张芳宾,等.T细胞斑点试验在肠结核与克罗恩病鉴别诊断中的价值[J].河南医学研究,2013(1):47-50.

[11] 邱志兵,钟良,杨海静,等.T细胞斑点试验在肠结核诊断的初步探讨[J].中国感染与化疗杂志,2012,12(5):381-383.

[12] 陈瑜君,何瑶,陈白莉,等.PCR法检测结核分枝杆菌DNA在鉴别克罗恩病与肠结核中的价值[J].中国病理生理杂志,2013,29(1):188-192.

Value of T-cell spot test and DNA detection of tuberculosis in diagnosing intestinal tuberculosis

Zhao Chuncheng,Zhou Gang,Li Yuanhong,Zhang Lin

Department of Gastroenterology,Central Hospital of Jiangjin District,Chongqing,402260,China

Objective To explore the value of T cell spot test(T-spot-TB)and detection of tuberculosis DNA in the diagnosis of intestinal tuberculosis.Methods A retrospective analysis was made to the clinical data of 128 suspected cases with intestinal tuberculosis undergoing T-cell spot test and DNA detection of tuberculosis in the period from June,2009 to April,2013,including 72 cases with intestinal tuberculosis of confirmed diagnosis and 56 cases with no intestinal tuberculosis;a contrast analysis was made to the sensitivity and specificity of the 2 methods in diagnosing intestinal tuberculosis.Results The sensitivity of T-cell spot test in diagnosing tuberculosis was 90.3% and the specificity was 91.1%,while the sensitivity of DNA detection of tuberculosis was 73.6% and the specificity was 100%;the sensitivity of T-cell spot test in diagnosing intestinal tuberculosis was higher than that of DNA detection,but its specificity was lower than that of DNA detection;the positive rates of the 2 methods were of no obvious difference in cases with intestinal tuberculosis of different pathological manifestation;the positive and negative predictive values of the 2 methods when performed simultaneously were 100%.Conclusions To perform T-cell spot test and DNA detection of tuberculosis at the same time can promote the sensitivity and specificity in diagnosing intestinal tuberculosis.

intestinal tuberculosis;mycobacteriumtuberculosis;T-cell;spot test;DNA detection;diagnosis

402260 重庆,重庆市江津区中心医院消化内科

R 526

A

1004-0188(2014)09-0955-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.09.011

2014-06-19)