IGSF4基因在非小细胞肺癌中甲基化状态及其意义研究

朱剑武,李梦侠,王 东,高 天

IGSF4基因在非小细胞肺癌中甲基化状态及其意义研究

朱剑武,李梦侠,王 东,高 天

目的 通过MassARRAY 质谱甲基化测序检测,分析IGSF4基因的启动子区在非小细胞肺癌(NSCLC)中的甲基化修饰规律和特点,进一步探讨NSCLC早期诊断新方法。方法 首先利用MassARRAY 质谱甲基化测序及甲基化特异PCR(MSP)观察该基因在NSCLC中的甲基化状态,再通过RT-PCR验证其在NSCLC中表达情况。结果 MassARRAY 质谱甲基化测序方法对7例NSCLC和3例正常对照血样检测结果显示,IGSF4基因启动子区8个CpG位点在NSCLC中甲基化程度明显增高(P<0.01),呈高度甲基化状态；MSP结果亦显示,IGSF4基因在NSCLC中与正常外周血比较呈高甲基化；在细胞水平上进一步验证IGSF4基因表达情况,结果发现该基因在NSCLC中呈低表达。结论 IGSF4基因在NSCLC中呈高甲基化状态,在NSCLC中低表达,可作为无创性早期诊断NSCLC的新方法。

非小细胞肺癌；DNA 甲基化；IGSF4；A549细胞株；MSP

肺癌在本质上是一个基因疾病,肺癌的发生发展是一个癌基因激活、抑癌基因失活的多基因参与的多步骤、多阶段,由体内外因素相互作用的复杂过程。大量研究发现,各种癌症都可以发现存在有抑癌基因启动子区的异常甲基化,从而带来转录抑制,肺癌也如此[1]。目前,对非小细胞肺癌(NSCLC)的分型诊断只能通过常规的病理诊断、影像学分析及相关辅助检查进行鉴别分析,尚没有一个明确的可以真正指导临床对NSCLC进行病理分型的特异标志物。文献报道[2],44%的NSCLC的IGSF4 基因的启动子发生甲基化。本课题组在既往的研究中发现,IGSF4基因启动子在NSCLC中mRNA水平有明显变化,即在NSCLC中该基因的表达量明显低于正常组织。本研究拟通过MassARRAY质谱甲基化检测平台,分析IGSF4 基因的启动子区在NSCLC中的甲基化修饰规律和特点,以期指导临床NSCLC病理分型的早期诊断,为临床肺癌分型开拓新途径。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择本院2012年6～12月采集的已明确诊断的NSCLC患者血液标本共8例(包括第一阶段MassARRAY 质谱甲基化测序检测实验所用7例和MSP验证新增的1例),患者无任何基础疾病及免疫抑制剂治疗史。对照正常血液标本取自健康体检成人外周静脉血共6例(包括第一阶段实验用3例和第二阶段MSP新增3例)。并同时收集检测对象的临床资料,包括患者的年龄、性别、民族、籍贯、联系电话等一般信息,临床常规检测指标及病理诊断。本研究得到本院医学伦理委员会批准,取材均征得检测对象知情同意。

1.2 样本基因组DNA及RNA的提取 基因组DNA提取试剂盒购自MN公司,提取过程按试剂盒说明操作；基因组DNA的亚硫酸盐处理所用的试剂盒CpGenome DNA modification Kit购自Qiagen公司,处理过程按试剂盒说明操作。总RNA提取采用Trizol(北京百泰克生物公司)提取外周静脉血中总RNA,通过异丙醇沉淀法浓缩RNA,进一步采用NucleoSpin RNA clean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL,Germany)对总RNA进行过柱纯化,用Nonadrop测定浓度和纯度,并电泳检测其完整性。

1.3 MassARRAY Epityper DNA甲基化定量检测 通过MassARRAY Epityper DNA甲基化定量技术,检测各标本中IGSF4基因启动子甲基化程度。MassARRAY Epityper DNA平台是结合碱基特异性酶切(分子切割)和MALDI-TOF检测原理,实现多重CpG的分析检测,该检测分析由亚硫酸盐处理待测DNA开始,经过亚硫酸盐处理,DNA中未甲基化胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U),而甲基化修饰的胞嘧啶不受影响,因此,亚硫酸盐处理将产生甲基化特异的序列变化。然后利用5'末端带有T7-启动子的引物进行 PCR 扩增,产物经碱基特异性的酶切反应后,DNA 片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化,飞行质谱(北京博奥生物芯片有限公司)能测出每个片段的分子量,配套软件EpiTYPER自动报告每个相应片段的甲基化程度[3]。

1.4 甲基化敏感性PCR(MSP) dNTPs购自TaKaRa公司,DNA纯化试剂盒购自MN公司,Hot star enzyme Kit购自Qiagen公司,甲基化特异性PCR引物均由Invitrogen公司合成。具体步骤参照试剂盒说明。

1.5 荧光定量PCR 选取正常人肺细胞株MRC和肺癌细胞株A549(由本课题组传代获得),观察IGSF4在其表达情况。采用晶芯®SuperGreen荧光定量PCR通用试剂盒,实验方法按说明进行。引物采用Oligo6.0软件设计。总RNA的提取方法同“1.2”,用Nonadrop测定浓度和纯度,并电泳检测其完整性。RNA分光光度计进行RNA定量时,D(260)/D(280)在1.8～2.0,甲醛变性凝胶电泳28 S和18 S rRNA比值在2.0左右。镜下观察细胞生长状态良好,生长密度超过80%,可以用于RNA提取；RNA逆转录后待扩增。看家基因采用β-actin基因。引物设计如表1。

表1 IGSF4、β-actin基因实时PCR引物序列

2 结果

2.1 聚类分析结果 采用分层聚类分析方法,对7例NSCLC和3例正常对照血样MassARRAY Epityper DNA甲基化定量检测结果进行分析。结果显示,成功将NSCLC与正常外周血区分成两部分,IGSF4基因启动子区在NSCLC中呈高度甲基化(图1)。

图1 MassARRAY Epityper DNA甲基化定量检测结果IGSF4基因分层聚类分析结果

深色部分代表甲基化程度高,浅色区域代表甲基化程度低

2.2 IGSF4基因CpG位点的分析结果 将8个被检测到的CpG位点的甲基化程度逐一进行t检验的统计学分析,结果显示,8个位点在NSCLC样品与对照组中均有显著性差异(P<0.01,表2),进一步证实与芯片聚类分析结果一致。

表2 IGSF4基因8个被检测到的CpG位点t检验结果

注：样品1～7为NSCLC；8～10为正常外周血

2.3 甲基化特异PCR(MSP)验证结果 MSP结果显示,IGSF4基因在NSCLC中与正常外周血比较也呈高甲基化状态(图2)。

2.4 IGSF4基因在NSCLC细胞株中表达情况 β-ACTIN实时定量PCR结果显示,与正常人MRC-5细胞株比,该基因在肺癌细胞株A549中呈低表达(图3)。

图2 MSP检测结果

M：Marker,DL2000；1～8：NSCLC；9～14：正常外周。此部分实验样品在结果1中所用标本基础上新增1例NSCLC样品及3例正常外周血标本

图3 IGSF4基因与β-ACTIN实时定量PCR鉴定

M：Marker,DL2000；1：IGSF4基因-A549细胞株；2：IGSF4基因-MRC-5细胞株；3：β-ACTIN-A549细胞株；4：β-ACTIN-MRC-5细胞株

3 讨论

从蛋白水平检测分析,目前相对比较认同的肺癌相关肿瘤标志物有CEA、NSE、CA125、CYFRA21-1、VEGF等[4],但尚没有一个明确的可以真正指导临床对NSCLC进行病理分型的特异标志物。

随着DNA 甲基化检测技术的发展和完善,通过寻找受甲基化调控的新位点来诊断和治疗疾病,已经逐渐成为相关肿瘤的分子诊断和治疗的手段之一[5]。DNA甲基化状态的改变是肺癌发生的重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达[6]。IGSF4是免疫球蛋白超家族新成员,IGSF4 编码的一段1.6或4.4 kb RNA序列位于11q23.2,最终翻译成一个442个氨基酸的蛋白质。已经证实IGSF4甲基化失活与肺癌、胰腺癌的发生及预后相关[7-9],而国内外尚未见有IGSF4基因的启动子区在NSCLC中的甲基化情况以及分子机制的研究报道。

本课题前期通过体外实验观察IGSF4在两种细胞株中甲基化状态,分别用人正常肺细胞株MRC-5和肺癌A549细胞株,通过MSP方法验证了IGSF4基因确实是甲基化程度高的基因位点。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生,因此,基因组的甲基化检测对于肿瘤的提前诊断和监测肿瘤的发展具有重大的意义。本研究经MassARRAY质谱甲基化测序方法[10-11],对7例NSCLC和3例正常对照血样对比分析,结果显示,被检测的IGSF4启动子区8个CpG位点在NSCLC中甲基化程度明显增高(P<0.01),呈高度甲基化状态；在表达水平上对IGSF4基因进行了实时定量PCR验证,结果显示,与正常人MRC-5细胞株比,该基因在A549细胞株中呈低表达。

综上分析推测,IGSF4基因启动子在NSCLC中较正常组织甲基化程度高,并且这种差异可能指导临床对NSCLC的早期诊断。因此,本研究将进一步探讨IGSF4基因与NSCLC发生发展的关系,为临床提供新的NSCLC病理分型的分子标记靶点。

[1] Christine M Kiefera,Chunhui Houa,Jane A,et al.Epigenetics of β-globin gene regulation[J].Mutation Research,2008,647(10):68-76.

[2] Kikuchi S,Yamada D,Fukami T,et al.Hypermethylation of the TSL-C1/IGSF4 promoter is associated with tobacco smoking and a poor prognosis in primary nonsmall cell lung carcinoma[J].Cancer,2006,106(8):1751-1758.

[3] Tian Gao,Yanli Nie,Hua Hu,et al.Hypermethylation of IGSF4 gene for noninvasive prenatal diagnosis of thalassemia[J].Med Sci Monit,201218(1):BR33-40.

[4] 顾咸庆,杨雪琴,杨宇馨,等.APE1和VEGF在非小细胞肺癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成和预后的关系[J].重庆医学,2012(11):1047-1054.

[5] Liu WJ,Tan XH,Guo BP,et al.Associations between RASSF1A promoter methylation and NSCLC:a meta-analysis of published data[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(6):3719-3724.

[6] Ponomaryova AA,Rykova EY,Cherdyntseva NV,et al.Potentialities of aberrantly methylated circulating DNA for diagnostics and post-treatment follow-up of lung cancer patients[J].Lung Cancer,2013,81(3):397-403.

[7] Murray PG,Fan Y,Davies G,et al.Epigenetic silencing of a proa-poptotic cell adhesion molecule,the immunoglobulin superfamily member IGSF4,by promoter CpG methylation protects Hodgkin lymphoma cells from apoptosis[J].Am J Pathol,2010,177(3):1480-1490.

[8] Kuipers JE,Coenen EA,Balgobind BV,et al.High IGSF4 expression in pediatric M5 acute myeloid leukemia with t(9;11)(p22;q23)[J].Blood,2011,117(3):928-935.

[9] Liang QL,Chen GQ,Li ZY,et al.Function and histopathology of a cell adhesion molecule TSLC1 in cancer[J].Cancer Investigation,2011,29(2):107-112.

[10] Tian Gao,Yanli Nie,Jianxin Guo.Hypermethylation of the gene LARP2 for noninvasive prenatal diagnosis of β-thalassemia based on DNA methylation profile[J].Mol Biol Rep,2012,39(6):6591-6598.

[11] Heller G,Babinsky VN,Ziegler B,et al.Genome-wide CpG island methylation analyses in non-small cell lung cancer patients[J].Carcinogenesis,2013,34(3):513-521.

Study on methylation status of gene IGSF4 in NSCLC and significance

Zhu Jianwu1,Li Mengxia1,Wang Dong1,Gao Tian2

1.Cancer Center,Research Institute of Surgery,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,400042,China;2.Department of Gynecology and Obstetrics,the First Affiliated Hospital to Chongqing Medical University,Chongqing,400041,China

Objective To analyze the regulation and characteristics of methylation of the promoter region of the gene IGSF4 in NSCLC with MassARRAY Epityper for a further study of new early diagnostic method of NSCLC.Methods MassARRAY Epityper and methylation-specific PCR(MSP)were applied to observe the methylation status of the gene in NSCLC and the expression of the gene in NSCLC were verified by real-time PCR.Results The detection results of blood samples from 7 cases with NSCLC and 3 normal controllers by MassARRAY Epityper revealed a hypermethylation of 8 CpG sites in the promoter region of IGSF4(P<0.01);the results of MSP also showed a hypermethylation of IGSF4 in NSCLC;the result of real-time PCR showed a lower level of IGSF4 in NSCLC patients than the normal control in the cellular level.Conclusions IGSF4 is in hypermethylation status and low expression in cellular level in NSCLC,which may serve as a new method of noninvasive early diagnosis of NSCLC.

NSCLC;DNA methylation;IGSF4;A549;MSP

重庆市自然科学基金(CSTC2010BB5198)

400042 重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心(朱剑武,李梦侠,王 东)；重庆医科大学附属第一医院妇产科(高 天)

高 天,电话：0801-757207；E-mail：cecilia7@sohu.com

R 734.2

A

1004-0188(2014)09-0932-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.09.002

2014-07-22)