维吾尔族妇女宫颈癌与新一类肿瘤特异性上调表达基因调控的关系研究

吐尔逊帕夏·吾布力卡斯木， 玛依拉·卡米力江， 刘开江， 希尔扎提·苏来曼，热孜万古丽·约麦尔， 哈丽丹·热依木， Abulizi Abudula,4

(新疆医科大学1维吾尔医学院， 2基础医学院生物化学教研室， 3附属肿瘤医院妇科,4新疆地方病分子生物学实验室， 乌鲁木齐 830011)

新疆维吾尔族妇女是我国宫颈癌高发人群，其有效治疗的关键是早期发现。但是，由于现有临床技术对肿瘤的早期诊断能力有限，多数(中晚期)患者往往失去治疗良机[1-2]。肿瘤特异性差异表达基因的筛选是建立肿瘤分子诊断方法并实现早期发现的重要前提。以往报道中，通过宫颈癌与正常组织、宫颈鳞癌与腺癌以及宫颈癌早期与晚期的组织的全基因组表达谱芯片研究，发现一系列宫颈癌特异性差异表达基因[3-6]。但是，也发现基因表达谱存在人群或族群差异，可能与遗传背景、生活环境和流行病学特征等有一定的关系[7-9]。在前期研究中，研究维吾尔族妇女宫颈癌的全基因组表达谱芯片研究，发现一系列新的肿瘤特异性上调表达基因。故本研究采用半定量RT-PCR方法对6种发现的上调表达基因进行半定量鉴定，探讨宫颈癌发生与这些基因差异表达的关系，丰富宫颈癌早期预警指标体系，为宫颈癌预防、早期发现及有效治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 临床标本收集

收集2010-2011年在新疆医科大学附属肿瘤医院住院治疗并确诊的72例维吾尔族妇女宫颈病变患者的新鲜组织标本，其中CSCC为25例，CINⅡ～Ⅲ为22例，正常对照组为25例(主要是取自全子宫切除患者)。所有入选病例术前均未接受化疗或放疗，同时排除患有其他恶性肿瘤的患者，平均年龄为45.2岁(25～69岁)。

1.2 仪器和试剂

RNA提取相关的试剂由Qiagen公司提供。cDNA合成和PCR分析试剂分别为Fermentas和TAKARA公司产品。酚/氯仿、异丙醇和乙醇等化学试剂选自天津盛森精细化工公司，均为优级纯等级。主要仪器有高速低温离心机(Allegra-64R，Beckmann Coulter)、核酸/蛋白快速测定仪(GeneQuant-Ⅱ，GE公司)、PCR仪(iCycler，Biorad)和核酸凝胶成像系统(GelDoc-XR，Biorad)等。

1.3 实验方法

1.3.1 组织总RNA的制备 取新鲜冷冻组织50～100 mg，在液氮冷冻状态下碾碎，采用传统的Trizol法提取组织总RNA。测定浓度和OD260/280,并电泳检测RNA 的完整性，保存于-80℃冰箱。

1.3.2 引物设计与合成 在前期对维吾尔族妇女宫颈癌的全基因组表达谱研究的基础上，选取SHISA2、SIX1、DTL、DSG2、NUP62CL和APOBE63B 6种上调表达候选基因,并根据上述基因的RNA信息，设计每一种候选基因mRNA序列特异性PCR引物(表1)。

表1 候选上调表达基因的mRNA序列特异性引物

1.3.3 半定量RT-PCR方法 (1)根据组织总RNA浓度，取2 μg组织RNA，采用Fermentas试剂盒合成cDNA；(2)根据基于全基因组表达谱芯片分析，进一步选择特定候选上调表达基因，利用Genbank数据库检索，获得mRNA序列，设计与合成其特异性引物(引物均由TAKARA公司合成并经质量检测)；(3)以1 μL cDNA为模板，采用25 μL PCR体系，经预试验优化PCR条件后，对所有标本的cDNA模板进行PCR扩增，设PCR扩增程序为预变性95℃ 3 min,变性94℃ 45 s,35个循环、退火58～64℃ 45 s和合成72℃ 1.5 min,延长72℃/7 min。每次PCR扩增中，均设内参基因管和空白对照(dd H2O)。利用2%琼脂糖凝胶进行电泳分离，经凝胶成像分析后，利用Quantity One软件(凝胶成像仪自备软件)对PCR产物条带进行灰度值分析。候选基因的转录表达水平=目标基因的PCR产物灰度值/内参基因PCR产物灰度值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 PCR扩增结果

利用半定量RT-PCR方法，通过6种基因在宫颈癌、癌前病变及正常对照组内mRNA表达水平分析，PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证可知扩增片断长度和理论大小一致，且扩增条带单一，说明该引物有高度特异性(图1)。

CSCC与宫颈炎SHISA2、SIX1、DTL、DSG2、NUP62CL和APOBE63B 6种基因mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05),6种基因是宫颈癌特异性上调表达(高)基因，其中SHISA2、SIX1、DTL、DSG2和NUP62CL 5种基因表达水平差异更为显著(P<0.01)，可能更具有代表性。CSCC与CINⅡ～Ⅲ比较, SHISA2、SIX1、APOBEC3B和DSG2 4种基因表达水平存在显著差异(P<0.05)，其检测可能有助于鉴别肿瘤与癌前病变。CIN与宫颈炎比较发现只有SHISA2基因的表达水平存在差异(P<0.05)(表2)。

表2 6种宫颈病变组织特异性上调表达基因的半定量RT-PCR分析

3 讨论

宫颈癌是严重危害新疆维吾尔族妇女健康的一种疾病,因而宫颈癌的研究不仅可以解决肿瘤研究领域的共同问题,而且也是新疆肿瘤防治工作的重点, 一直倍受关注。宫颈癌发生发展是多步骤、多基因表达调控紊乱的复杂过程。因此，采用高通量检测技术——基因芯片对宫颈病变组织分析,一次实验就可观察某组织中成千上万个基因的表达变化,从而可以在整个基因组范围内进行基因表达并行分析,适合于对宫颈癌相关功能基因的大规模研究。

刘开江等[10]通过宫颈癌组织的人类全基因组芯片分析，发现了一系列宫颈癌组织特异性差异表达基因。本课题组在前期工作中，发现了新的宫颈癌特异性上调表达基因群，其中有SHISA2、SIX1、DTL、DSG2、NUP62CL和APOBE63B等。在此基础上，本研究对手术切除宫颈鳞癌、CINⅡ～Ⅲ及正常宫颈组织RNA进行半定量RT-PCR分析，发现6种基因在维吾尔族妇女宫颈癌、癌前病变及正常对照组内mRNA表达水平有差异。CSCC与宫颈炎之间SHISA2、SIX1、DTL、DSG2、NUP62CL和APOBE63B 6种基因mRNA表达水平均存在统计学差异，在CIN与宫颈炎之间仅发现SHISA2基因的表达水平差异显著。由于在CSCC与CINⅡ～Ⅲ之间SHISA2、SIX1、APOBEC3B和DSG2 4种基因表达水平差异也有统计学意义，其检测可能有助于鉴别肿瘤与癌前病变。上述候选基因中SIX1、DTL、DSG2基因mRNA表达水平在CSCC组织中最高，在CIN下降，在宫颈炎最低，但是SHISA2和NUP62CL 基因在CSCC组织中的表达水平低于CIN，APOBE63B基因在CIN组织中的表达水平低于宫颈炎。

SHISA2基因是Wnt、FGF信号途径的抑制因子，在胚胎发育过程中，特别是在内脏内胚层、体节、前脑、视泡和肢芽等器官的发育过程中起着重要作用[11 ]，该基因与肿瘤发生之间的关系尚未见报道。SIX1基因是最近发现的一种新同源盒基因[12], 最初的研究表明SIX1基因与组织器官的发育有关,可在细胞分化前促进前体细胞的增生和生存，此外SIX1基因还可促进细胞迁移、侵袭和产生间充质细胞表型[13]。当SIX1调控异常时,不但使胚胎发育和组织器官出现异常形态结构、胚胎死亡,而且在肿瘤发生和转移中发挥关键作用[14]。例如, SIX1在乳腺癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤中表达量增高[12，15-16]。郑秀惠等[13]发现该基因在宫颈癌组织中高表达。可见，SIX1基因的异常表达可诱发肿瘤的发生和促进肿瘤转移。结合本研究结果，可以推测SIX1基因转录表达水平上调确实与宫颈病变进程密切相关。DTL[denticle less homolog (Drosophila)]果蝇同源盒基因，表达于许多成人组织中，如上皮、乳腺、结肠、肾、睾丸及各级造血细胞中。目前国内外关于DTL基因在肿瘤发生发展中的作用及调控机制的研究甚少，Baraniskin等[17]发现该基因在结肠癌中高表达，提示该基因可能在肿瘤发生和转移中发挥关键作用,但其在宫颈癌中的作用及发病机制国内外尚无研究报道。DSG2( desmoglein 2)基因是沉默桥粒芯糖蛋白家族的成员之一，其低表达导致多种心肌相关基因表达改变,细胞凋亡增加,缝隙连接蛋白43、离子通道蛋白和心肌发育相关蛋白表达改变可能参与了心律失常性右室心肌病(ARVC)的发病[18]。APOBEC3B (Apolipoprotein mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide)是近年来新发现的一类哺乳动物物胞苷脱氨酶Apobec3蛋白酶家族的成员，是一种RNA/DNA编辑酶在研究中发现APOBEC3家族并非在所有组织中都有很高的表达,而仅在一些细胞系如鳞状细胞、结肠、小肠、睾丸、卵巢、结肠癌、Burkitfs淋巴瘤,慢性淋巴细胞白血病中相对表达增高[19]。目前对APOBEC3B基因的大多数研究主要与肝脏肿瘤发生及其机制有关，而针对其他肿瘤病变的研究报道很少，对于该基因与宫颈癌发生发展之间的研究几乎空白。

在本研究进行的同时本课题组对下调表达基因与维吾尔族妇女宫颈病变病理进程的关系进行探讨，发现DNASE1L3、EGR1、FOS、KLF和IER2 5种基因的表达水平变化可能成为宫颈癌早期预警指标[20]。从蛋白质表达水平检测可以更明确mRNA表达水平的差异，因而利用免疫组织化学和免疫印迹等方法进一步筛选并研究对低表达基因启动子甲基化水平变化与宫颈癌发生的关系，是本研究的后续工作任务。HPV是宫颈癌发生的危险因素，从HPV感染水平探讨上调表达基因，有助于了解上调表达候选基因表达水平变化与病毒感染的机制。

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