咪唑克生对EAE小鼠血脑屏障通透性及对MMP-9/TIMP-1的影响*

王新施， 曾庆意， 朱振国， 朱 攀， 徐惠琴， 郑荣远

(温州医科大学附属第一医院神经内科，浙江 温州 325000)

咪唑克生对EAE小鼠血脑屏障通透性及对MMP-9/TIMP-1的影响*

王新施， 曾庆意， 朱振国， 朱 攀， 徐惠琴， 郑荣远△

(温州医科大学附属第一医院神经内科，浙江 温州 325000)

目的： 观察咪唑克生(idazoxan，IDA)对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)时血脑屏障(BBB)通透性及脊髓内的MMP-9/TIMP-1表达的影响。 方法: 选用36只8周左右的C57BL/6小鼠，随机分为空白对照组、EAE组和IDA干预组，每组12只，采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)诱导经典EAE模型，干预组采用IDA 2 mg/kg腹腔注射，每天2次，共15 d。观察每组大鼠发病情况并进行神经功能障碍评分，采用HE染色和LFB髓鞘染色观察病理改变，采用伊文思蓝荧光定量方法检测BBB通透性的变化，并用Western blotting法检测MMP-9和TIMP-1的表达。结果: 空白对照组无一发病，与EAE组比较， IDA干预组神经功能障碍评分明显下降，炎性病灶明显减少，BBB通透性明显降低，MMP-9的表达和MMP-9/TIMP-1比值明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。结论: IDA可能通过下调MMP-9，降低MMP-9/TIMP-1比值，减轻血脑屏障的降解破坏，从而稳固BBB，降低BBB通透性，减缓小鼠EAE的发病。

咪唑克生; 血脑屏障; 基质金属蛋白酶9; 组织型基质金属蛋白酶抑制物1; 实验性自身免疫性脑脊髓炎

多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种以血管周围炎细胞浸润和髓鞘破坏为主要病理特征的中枢神经系统常见自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的临床表现和病理改变与其极为相似，被公认为是MS的动物模型。 由于它们的病因或发病机制尚未完全明了，防治也无理想的特效药物，于是成为有待深入探索的重大理论研究课题。有证据表明在MS/EAE活动期,基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)或MMP-9抑制物组织型基质金属蛋白酶抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1， TIMP-1)的平衡失调，导致MMP-9活性明显增加，进而降解血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)，导致BBB开放，在EAE/MS的发病中起了重要作用[1]。我们在前期的研究工作中已发现咪唑啉2受体(imidazoline 2 receptor，I2R)的配体咪唑克生(idazoxan，IDA)对大鼠EAE有明显缓减发病的作用[2-3]，然而该保护作用的机制不甚清楚，其对小鼠EAE的影响及对MMP-9/TIMP-1及BBB通透性的影响目前尚未有报道。本文旨在通过观察IDA对小鼠EAE的保护作用，检测分析EAE组与IDA干预组的BBB通透性及MMP-1/TIMP-1表达的变化，探讨IDA对EAE发生后BBB通透性的保护作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

36只雌性C57BL/6小鼠，清洁级，6～8周龄，体重18～20 g，购自军事医学科学院动物实验中心；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55 (myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG35-55) 由西安美联生物科技有限公司合成，纯度>95%。人结核分枝杆菌(M.tuberculosis，H37Ra)购自Difco；IDA、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)、百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、伊文思蓝和IDA购自Sigma；MMP-9抗体购自Abcam，TIMP-1抗体购自Santa Cruz。

2 实验方法

2.1 EAE模型的制备 采用MOG35-55作为致敏抗原诱导EAE模型，按目前公认的及本实验室已经建立的方法进行。用IFA将H37Ra稀释成0.008 mg/L的完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)， 用0.01 mol/L的PBS 将MOG35-55稀释成2.22g /L，然后将MOG稀释液与CFA等体积冰浴，快速混匀10 min至油包水状态，制成抗原乳剂。造模小鼠背部两侧分4点皮下注射抗原乳剂0.2 mL/只。免疫后当时和48 h给予小鼠腹腔注射PT(0.53 g/L，每只0.2 mL)。自免疫当天开始，每日观察小鼠的发病情况并进行神经功能障碍评分。

2.2 给药和分组 36只C57BL/6小鼠随机分为3组，每组12只，分别为：(1)IDA干预组：按照以上方法制备EAE模型后，从免疫第1天开始，给予IDA 2 mg/kg腹腔注射给药，每隔12 h注射1次(q12h)，连续14 d；(2)EAE组：按照以上方法制备EAE模型后，腹腔注射等量的生理盐水，q12h，连续14 d；(3)正常对照组：以PBS代替MOG35-55+CFA免疫后，腹腔注射等量的生理盐水，q12h，连续14 d，作为对照。

2.3 神经功能障碍评分 免疫当天起，每日观察小鼠发病情况并进行神经功能障碍评分，采用Weaver 15分法进行评分[4]：(1)尾巴：0分为无异常，1分为尾半瘫，2分为尾巴全瘫；(2)单一肢体：0分为无异常，1分为步态改变，2分为轻瘫，3 分为全瘫。以上累积评分，如尾巴和四肢全瘫则为 14 分，濒死为 15分。

2.4 病理学检查 各组随机取6只动物在EAE发病高峰期麻醉后断头处死，取出脑组织，4%多聚甲醛固定；常规石蜡包埋、切片。进行HE染色观察脑与脊髓的炎症细胞浸润情况，采用5分法进行病理组织学评分[5]：于高倍镜下计数炎症细胞，0 分= 无炎症细胞；1 分=炎症细胞浸润限于血管周围和脊髓周围；2分=脊髓内炎症细胞轻微浸润(1～10个/视野)；3分=脊髓内炎症细胞中度浸润(10～100 个 / 视野)；4分：脊髓内炎症细胞严重浸润(>100 个/视野)。每张切片随机计数5个视野后取平均值。同时切片进行LFB髓鞘染色，镜下观察髓鞘脱失程度，髓鞘染为蓝色，脱失后呈白色脱失斑块。并按照Kuerten等[6]的标准，对髓鞘脱失程度进行5分法评分：1分=微量软脑膜下髓鞘脱失； 2分=明显的软脑膜下和血管周围髓鞘脱失； 3分=融合成片的软脑膜下和血管周围髓鞘脱失； 4分=大片的软脑膜下和血管周围髓鞘脱失包括一半以上的脊髓实质炎症细胞浸润； 5=广泛的软脑膜下和血管周围髓鞘脱失包括全部的脊髓实质炎症细胞浸润。

2.5 BBB通透性检测 各组随机选取6只动物则于疾病高峰期或免疫后24 d处死，按照Uyama 等[7]的方法, 采用伊文思蓝荧光定量方法检测BBB通透性的变化。在发病高峰期用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠(0.35 g/kg体重)，从股静脉注入2% 伊文思蓝生理盐水溶液(4 mL/kg)1 h 后，开胸通过左心室灌注生理盐水(灌注压为110 mmHg)，直到右心房流出的液体呈无色为止，断头取脑。脑组织称重并置入50%三氯乙酸溶液中，匀浆和离心(10 000 r/min, 20 min) 后, 取上清液按1∶3 的比例用乙醇稀释。其荧光值通过荧光分光光度计测得，根据伊文思蓝溶液(100～500 mg/L) 的外在标准绘出伊文思蓝与荧光值之间的线性标准曲线，得出脑组织中伊文思蓝的含量，并用每克组织含量来表示。

2.6 Western blotting检测MMP-9和TIMP-1的表达 在制作上述病理学检查标本时留取不同组别的颈髓组织，切成小块放入离心管中。加入预冷的蛋白质抽提试剂，用匀浆器低速匀浆后，4 ℃离心15 min，转移上清液至新的离心管。用BCA蛋白定量方法测定MMP-9和TIMP-1蛋白的含量，并调整蛋白浓度。取等量的蛋白样品(50 mg)经20% SDS-PAGE分离蛋白样品，4 ℃湿转至PVDF膜。PVDF 膜在5% BSA 溶液中室温孵育1 h，然后加入稀释的MMP-9 (1∶1 000)及TIMP-1(1∶500)抗体，4 ℃孵育过夜。再加入辣根过氧化物酶标记的兔抗 IgG，室温孵育1 h，TBST洗膜5 min，3 次。将膜置于KCTM 化学发光试剂盒中室温孵育3 min后以X 光胶片曝光成像，用ImageJ 图像分析软件分析各条带的平均灰度值。

3 统计学处理

所有数据采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料(发病率)的比较则采用χ2检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠发病情况

小鼠于免疫后第10 天左右开始陆续发病，先表现为活动减少、进食少、体重减轻，继而陆续出现尾肌力降低、尾巴拖地不能抬起、后肢无力、步态异常、瘫痪等。其症状在发病后2～10 d逐渐加重达到高峰，持续1～6 d后开始缓解。空白对照组动物无一发病，EAE组12只动物全部发病，发病率达到100%，IDA干预组12只动物有10只发病，较EAE组发病率呈下降趋势，但差异无统计学意义。而IDA干预组动物的最大神经功能障碍评分明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2 病理组织学结果

空白对照组HE染色未见炎症细胞浸润；EAE组可见轻中度的炎症细胞浸润；给予IDA后，脑和脊髓浸润的炎症细胞数较EAE组明显减少，病理组织学评分较EAE组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。LFB髓鞘染色见发病小鼠CNS内有大小不等的片状髓鞘脱失，给予IDA后，发病动物脑和脊髓的脱髓鞘改变较EAE组明显减轻，脱髓鞘评分明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、表1。

表1 各组小鼠发病率、神经功能障碍和病理组织学评分

TableP<0.05 ,**P<0.01vsEAE.

Figure 1.The infiltration of inflammatory cells in mouse brain tissue detected by HE staining (×400). A: control group; B: EAE group; C: IDA group.

图1 小鼠脑组织HE染色所见炎症细胞浸润情况

Figure 2.The demyelination in mouse brain tissues detected by LFB staining (×400). A:control group; B: EAE group; C: IDA group.

图2 小鼠脑组织LFB髓鞘染色

3 BBB通透性检测结果

正常对照组脑内伊文思蓝含量很少，EAE组脑内有大量的伊文思蓝浸润，而IDA干预组脑内浸润的伊文思蓝含量明显减少，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，提示EAE组小鼠BBB通透性较正常对照组明显增加，而给予IDA干预后BBB得到稳固，其通透性明显降低，见表2。

4 MMP-9和TIMP-1的Western印迹法检测结果

各组小鼠颈髓组织标本的Western blotting法检测结果显示，EAE组的MMP-9表达较空白对照组明显升高，而IDA干预组的MMP-9较EAE组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。 EAE组的TIMP-1较空白对照组有降低趋势，IDA干预组TIMP-1与EAE组比较有升高趋势，但均无统计学差异。而EAE组的MMP-9/TIMP-1比值较空白对照组明显升高，而IDA干预组的MMP-9/TIMP-1比值较EAE组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3、表2。

Figure 3.The expression of MMP-9 and TIMP-1 protein detected by Western blotting.

图3 小鼠颈髓组织标本MMP-9及TIMP-1蛋白的表达

表2 各组BBB通透性和MMP-9/TIMP-1灰度比值结果

Table 2.The BBB permeability detected by Evans blue extravasation and expression of MMP-9/TIMP-1 detected by Western blotting (Mean±SD.n=6)

GroupEBcontent(mg/g)MMP-9/β-actinTIMP-1/β-actinMMP-9/TIMP-1EAE17.32±0.900.63±0.090.52±0.081.25±0.27IDA13.26±0.59**0.52±0.08**0.61±0.080.92±0.20**Control1.25±0.12**0.31±0.04**0.55±0.080.57±0.09**

*P<0.01vsEAE.

讨 论

过去我们曾观察到IDA 1.5、 2、 4.5 mg/kg均有明显减缓Wistar大鼠EAE发病的作用[2-3]，但IDA对其它种属动物的保护作用尚未见报道。本实验选用C57BL/6小鼠，根据以往实验结果选择了中间2 mg/kg的剂量，结果进一步在小鼠身上验证了IDA(2mg/kg)减缓EAE的保护作用。结合2种不同鼠种的实验结果，提示IDA在1.5～4.5 mg/kg这个剂量范围内确实具有减缓EAE的保护作用，为IDA进一步应用于其它动物甚至人类提供了理论支持。除此之外，本实验最重要的发现是首次观察到了IDA干预后，MMP-9或MMP-9/TIMP-1比值明显下降，使得MMP-9活性降低，BBB破坏减轻，通过EB荧光定量法检测到的BBB通透性降低。

血脑屏障功能失调是MS/EAE的一个重要病理途径，研究发现，在EAE发病时及MS临床复发时都存在BBB功能失调，BBB通透性增加，导致外周炎症细胞和炎症因子向中枢迁移，是EAE/MS发病的一个重要环节，BBB的通透性与EAE的严重程度呈正相关[8]。但EAE/MS中BBB破坏的机制仍不明确。EAE/MS时，中枢的炎症因子如肿瘤坏死因子α等能诱发MMP-9的产生[9]，MMP-9作为最重要的降解BBB的酶，不但能降解Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白等基底膜的主要成分，也能降解BBB紧密连接蛋白ZO-1, 导致BBB开放，炎症细胞和炎症因子进入CNS诱发MS/EAE[10]。在MS/EAE活动期，MMP-9浓度升高，或者MMP-9与其抑制物TIMP-1的平衡失调导致MMP-9活性明显增加，被认为是MS/EAE的一个重要活动性标志[11]。MMP-9的水平高低被认为与MS的病情严重程度、药物抵抗性等直接相关，即EDSS评分较高和药物抵抗的MS病人血浆的MMP-9水平明显升高[12], 而在动物模型中也发现EAE小鼠的病情越重、MMP-9水平越高的现象[13]。

与以往的这些研究一致，本实验也发现EAE组小鼠颈髓组织的MMP-9浓度较正常对照组明显升高，同时BBB通透性也明显升高。而IDA 2 mg/kg腹腔注射给药、q12h、连续14 d干预后，EAE小鼠的行为学和病理组织学改变明显减轻的同时，MMP-9或MMP-9/TIMP-1比值明显下降，通过EB荧光定量法检测到的BBB通透性明显降低，提示IDA可能通过降低MMP-9活性，减轻EAE时的BBB破坏，从而起到减缓EAE的作用。实际上，降低MMP-9或者MMP-9/TIMP-1比值、稳固BBB早已是MS/EAE一个重要的治疗靶点。研究发现，无论是作为MS急性期主要治疗药物的糖皮质激素，还是作为MS缓解期主要治疗药物的IFN-β，其治疗作用都与降低MS病人外周血的MMP-9水平[14]或逆转病人血清/脑脊液MMP-9/TIMP-1的平衡失调[15]，从而降低BBB通透性有关[16-17]。而本实验结果也预示着IDA有望和糖皮质激素及IFN-β一样成为治疗MS的重要药物。

综上所述，IDA慢性干预能减缓小鼠EAE的发病，减轻EAE小鼠的中枢炎症细胞浸润和脱髓鞘改变，这些作用可能与IDA下调MMP-9或MMP-9/TIMP-1，从而稳固BBB、降低BBB的通透性有关。

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Effect of idazoxan on permeability of blood-brain barrier and expression of MMP-9/TIMP-1 in mouse experimental autoimmune encephalomyelitis

WANG Xin-shi, ZENG Qing-yi, ZHU Zhen-guo, ZHU Pan, XU Hui-qin, ZHENG Rong-yuan

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:zhengry2013@163.com)

AIM: To study the effect of idazoxan (IDA) on the permeability of blood-brain barrier (BBB) and the expression of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) in mouse experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).METHODS: Female C57BL/6 mice (n=36) were randomly divided into control group, EAE group and IDA group, with 12 mice in each group. EAE was induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55). IDA (2 mg/kg, ip, bid) was administered for 15 d after immunization. The neurological defects of the mice were observed daily and scored. The pathological changes were observed under microscope with HE staining and LFB myelin staining. The BBB permeability was detected by Evans blue extravasation. The expression of MMP-9 and TIMP-1 in the brain of EAE mice was determined by Western blotting.RESULTS: Compared with EAE group, the score of neurological defects in IDA group was decreased, the inflammation was relieved, the BBB permeability was reduced, and the expression MMP-9 and the ratio of MMP-9/TIMP-1 were decreased (P<0.05).CONCLUSION: The neuroprotective effect of IDA on mouse EAE might be related to the down-regulation of MMP-9 and the ratio of MMP-9/TIMP-1, thus reducing the degradation of BBB and the permeability of BBB, and ameliorating the pathologic process of EAE.

Idazoxan; Blood-brain barrier; Matrix metalloproteinases 9; Tissue inhibitor of metalloproteinase 1; Experimental autoimmune encephalomyelitis

1000- 4718(2014)12- 2254- 05

2014- 07- 10

2014- 09- 16

国家自然科学基金资助项目(No. 81070960)； 浙江省自然科学基金资助项目(No. LQ12H09002)

R363； R774.5+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.024

△ 通讯作者 Tel: 0577-55589361; E-mail: zhengry2013@163.com