枳壳药材水提液HPLC指纹图谱研究

陈 刚， 魏鸿雁， 刘江华， 石明辉， 徐晓琴

(1新疆维吾尔自治区中药民族药研究所， 乌鲁木齐 830002； 2国药集团新疆制药有限公司， 乌鲁木齐 830032)

枳壳为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种的干燥未成熟果实。7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥[1]。枳壳因产地不同，有江枳壳(产于江西)、川枳壳、湘枳壳、苏枳壳(江苏、浙江产地)4种[2]。枳壳富含黄酮、生物碱、糖类和有机酸等成分。枳壳中的黄酮类成分主要是柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异柚皮苷、橘红素、川陈皮素等；生物碱类成分是辛弗林和N-甲基酪胺等。其中新橙皮苷与橙皮苷、芸香柚皮苷(异柚皮苷)与柚皮苷分别为同分异构体[3]。目前已有关于枳壳药材的甲醇提取液HPLC指纹图谱的报道[4-5]，而传统的中药是以水煎液作为主要使用方式。本研究拟建立枳壳药材的水提液的特征指纹图谱方法，以期为药材质量的评价及临床应用提供依据。

1 仪器与试剂

1.1仪器美国安捷伦公司1100型液相色谱仪(美国安捷伦公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、检测器、工作站)，KQ-250DB数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，BP211D电子分析天平(Sartorius CO.)。

1.2试剂柚皮苷(Naringin)、新橙皮苷(Nehesperidine)对照品由中国生物制品检定所提供，纯度>98%；异柚皮苷(isonaringin)由上海融禾医药科技有限公司提供，纯度>98%；乙腈、甲酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3药材来源枳壳药材样品于2009年6-7月采自于江西省。

2 方法与结果

2.1色谱条件及系统适应性试验色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%甲酸，流动相梯度比例见表1；检测波长为254 nm，流速为1 mL/min，理论塔板数按柚皮苷计算应不低于2 500。

表1 流动相梯度比例

2.2对照品溶液的制备精密称取取柚皮苷、新橙皮苷、异柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含柚皮苷1.0 mg、新橙皮苷0.5 mg、异柚皮苷0.10 mg的溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备取样品中粉2 g, 精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流2 h, 放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。

2.4测定方法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，即得。

2.5方法学考察

2.5.1 精密度试验 取同一供试品溶液连续进样6次，检测指纹图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间的RSD<2%，相对峰面积的RSD<3%。采用国家药典委员会推荐的“计算机辅助相似度评价系统”2004版软件进行数据处理，相似度值>0.95，表明仪器系统的精密度良好，符合指纹图谱的检测要求。

2.5.2 稳定性试验 取同一供试品液分别于0、2、4、8、12、24 h检测指纹图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间的RSD<2%，相对峰面积的RSD<3%。采用国家药典委员会推荐的“计算机辅助相似度评价系统”2004版软件进行数据处理，比较在不同时间的色谱图，对指纹图谱进行考察，相似度值均>0.95，符合指纹图谱的要求，表明枳壳水提液在常温下24 h内稳定。

2.5.3 重复性试验 取同一供试品6份，每份1 g，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备样品。结果表明，各色谱峰的相对保留时间的RSD均<2%，相对峰面积的RSD<3%。采用国家药典委员会推荐的“计算机辅助相似度评价系统”2004版软件进行数据处理，6份样品测得的色谱图相比较，相似度值>0.95，符合指纹图谱的要求。

2.5.4 指纹图谱测定与结果分析 取不同批次的枳壳药材，按“2.3”项下方法制备成供试液。分别取供试品溶液和对照品溶液，进样分析，得各批次样品的HPLC指纹图谱。从15批药材的指纹图谱中共发现12个共有峰，通过与对照品色谱峰比对，指认出指纹图谱中的3个特征峰，1号峰为异柚皮苷，2号峰为柚皮苷，5号峰为新橙皮苷。以5号峰为参比峰，计算12个共有峰的相对保留时间见表2，12个共有峰的相对峰面积见表3。15批枳壳药材水提液样品HPLC指纹图谱和对照图谱分别见图1和图2。

结果15批药材的12个共有峰的相对保留时间的RSD值均<0.805%，说明药材水提液的组成基本相似，且方法的稳定性较好(表2)；15批药材的12个共有峰的相对峰面积变化较大，其中变化最大的为9号峰，其相对峰面积RSD为196.7%，说明不同样品中化学成分的含量变化较大(表3)。

表2 15批枳壳药材水提液样品HPLC指纹图谱中12个共有峰的相对保留时间

表3 15批枳壳药材水提液样品HPLC指纹图谱中12个共有峰的相对峰面积

2.5.5 样品的相似度 采用国家药典委员会推荐的“计算机辅助相似度评价系统”2004版软件进行数据处理。该软件的特点为可将多个色谱图进行比较，得到多个色谱图特征的共有模式色谱图。再以此模式为基准，计算每个色谱图与之获得的对照图谱比较相似度，采用相关系数进行评价。将15批样品的指纹图谱试验数据导入中药指纹图谱相似度计算软件(2004版)，通过选峰、设定匹配模式、将色谱峰自动匹配、设定标准模板选定等过程进行谱峰的差异性评价和整体相似度评价。结果表明，以对照谱图为参照，15批样品的相似度为0.814～0.996，说明15批药材的相似度较好。

3 结论

本文从中药临床用药特点(水煎)出发，对枳壳水提液的指纹图谱进行研究，更加切合实际，为中药的质量评价提供了一种切合实际的思路。枳壳药材中黄酮类的成分含量较高，以柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等为代表的黄酮类成分可以很好地进入水煎液中，本方法建立的枳壳水提液中黄酮类成分的特征指纹图谱具有一定指导临床用药的意义。

参考文献:

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:229-230．

[2] 王青,袁丹.不同产地枳实与枳壳中黄酮类成分的含量测定[J].黑龙江医药,2008,3(21):1-3.

[3] 潘隽丽,杨翠平,苏薇薇.枳壳类药材的研究概况[J].中药材,2003,26(10):768-770.

[4] 张水寒,杨永华,蔡萍等.枳壳药材甲醇提取物的高效液相指纹图谱研究[J].中成药,2006,25(10):1405-1408.

[5] 杨翠平,苏薇薇,劳业兴等.枳壳药材HPLC指纹特征研究[J].中药材,2003,26(6):405-408.