伊木萨克片对异常黏液质型阳痿病证大鼠模型性腺轴调节作用的形态学研究

张盼盼， 朱颜刘莹， 阿地力江·伊明， 刘凤霞， 李建勇， 阿莱·巴合提汗， 阿卜杜热伊木江·如则， 迪丽达尔·库德热提，买买提祖农·买苏尔

(新疆医科大学基础医学院1人体解剖学教研室， 2病理生理学教研室， 3微生物学教研室，乌鲁木齐 830011)

阳痿是维吾尔医学(维医)男科诊疗的优势病种。在千百年来发展过程中，维医临床对阳痿的诊断模式不断成熟，并发展了独特的特色方药治疗手段。阳痿是指男子阴茎不举或举而不坚为主要特征的病症，在现代医学中称为阴茎勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)，并可见性欲减低与早泄等症状[1]。其维医证型按照体液论分为异常黏液质型、异常血液质型、异常胆液质型和异常黑胆质型阳痿4种，其中尤以异常黏液质型阳痿发病率最高。经典男科维药伊木萨克片(国药准字 Z65020144)是公认的异常黏液质型阳痿病证的对证药物,源自1874年出版的维吾尔医学典籍《医科思热爱扎穆》[2],已编入维吾尔医学高校教材《维吾尔医成药学》中[3]。

本课题组前期研究工作中，以维吾尔医学理论为指导，采取湿寒环境和湿寒饲料复合干预的方法建立了异常黏液质证候大鼠模型，并在此基础上，成功筛选出阳痿病证模型，在对其生殖生物学基础进行系列研究的过程中，发现该病证的发生发展与性腺轴相关激素的改变，以及由此引发的神经内分泌功能紊乱相关。本研究从形态学角度观察了异常黏液质型阳痿病证性腺轴改变及对证维药伊木萨克片的影响，以探寻其生殖激素改变和该药调节作用的组织学和细胞学基础。

1 材料与方法

1.1实验动物取有正常性功能的雄性(SD)大鼠90只(由交配实验证实)，雌性大鼠20只，体质量(200±20)g，由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.2主要仪器与试剂BIC-400 型人工气候箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，BS-1105 型电子天平(北京赛多科斯天平有限公司)，DHG-9245A 型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。阿朴吗啡(Apomorphine,APO，美国Sigma公司)，黄体酮(浙江仙琚治药股份有限公司, 批号：120804)，雌二醇(宁波市三生药业有限公司，批号：B130613)，伊木萨克片(新疆和田维吾尔药业有限责任公司，批号：20130501)。

1.3动物分组和模型的建立

1.3.1 分组 90只雄性SD大鼠，经交配实验证实具有正常性功能后，从中随机抽取10只为正常对照组(简称正常组)，余80只为造模组。实验前适应性饲养1 w，大鼠自由饮食水，12/12 h昼夜交替饲养，饲养环境温度为(22±2)℃，湿度为(55±5)%，并对大鼠生物学表征进行观察和记录，1 w后进入造模阶段。

1.3.2 湿寒饲料的制备 按每千克大鼠常规饲料中加入芫荽实和菠菜实各150 g。饲料由新疆医科大学实验动物中心制备，芫荽实和菠菜实均购自新疆维吾尔自治区维吾尔医院草药房。

1.3.3 异常黏液质证候模型的建立与分组 正常组用常规方法饲养，温度为(22±2)℃，湿度为(55±5)%，每日给500 g普通饲料、1 000 mL水、200 g垫料。造模组放置于人工气候箱中饲养，温度(8±2)℃，湿度(85±5)%，于10∶00～20∶00/22∶00～10∶00分2批交替放入。造模组每组每日给湿寒饲料500 g，水与垫料同上。造模组与正常组均随机饮食水，12/12 h人工照明，固定每日20∶00～22∶00给予饲料、水，更换垫料，并动态观测生物学表征的变化。20 w后，通过APO勃起实验和交配实验筛选出阳痿病证模型，将其随机分为病证模型组、药物干预组。

1.3.4 药物干预 分组完毕后，将药物干预组于常规条件下饲养，常规饮食，并用对证药物伊木萨克片250 mg/kg灌胃，每天1次，余各组均予以等剂量蒸馏水灌胃，干预2 w，并行生物学表征观测、APO勃起实验和性行为学实验，通过与正常组和模型组的比较，确定药物的干预效果。

1.3.5 取材 干预2 w后，将所有大鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，取下丘脑、垂体和睾丸，将体积<1 mm3的组织，用4%戊二醛和1%锇酸双固定，剩余部分于4%多聚甲醛固定。

1.4观察指标将甲醛固定的下丘脑、垂体和睾丸组织进行石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察；将戊二醛和锇酸双固定的组织丙酮梯度脱水，Epon环氧树脂包埋切片，铅铀染色，JEOL JEM1230透视电镜下观察。

2 结果

2.1下丘脑观察结果(1)正常组：光镜下可见神经元细胞结构正常，胞核清晰，胞浆丰富，间质无水肿(图1-1)。电镜下神经胶质细胞基质密度均一，细胞器均正常，核圆形或椭圆形，异染色质较多，呈团块位于核膜下(图2-1)；神经元基质密度尚可，细胞内有较多游离核糖体，粗面内质网较发达(图2-4)。(2)病证模型组：光镜下可见血管扩张充血，基质疏松，呈网状结构，部分细胞核染色较浅，有空泡样病变，提示有水肿(图1-2)。电镜下神经胶质细胞基质密度明显下降，胞核异染色质增多，核周隙增宽，细胞器较少且分布较散，线粒体水肿呈空泡样病变，内质网轻微扩张(图2-2)；神经元核膜界线不清，核形不规则，异染色质增多，线粒体基质密度下降，线粒体嵴排列松散，粗面内质网有轻度扩张(图2-5)。(3)药物干预组：光镜下可见基质水肿减轻，细胞核染色较淡(图1-3)。电镜下神经胶质细胞基质密度有所升高，少数线粒体水肿呈空泡样变(图2-3)；神经元核膜清晰，核形规则，粗面内质网未见扩张(图2-6)。

1：正常组下丘脑(×400) 2：病证模型组下丘脑(×400) 3：药物干预组下丘脑(×400)

7：正常组睾丸(×400) 8：病证模型组睾丸(×400) 9：药物干预组睾丸(×400)

2.2垂体观察结果(1)正常组：光镜下可见腺垂体嗜酸性细胞呈圆形或椭圆形，嫌色细胞较小，圆形或多边形，胞质染色浅；神经垂体见无髓神经纤维，其间有丰富的窦状毛细血管(图1-4)。电镜下细胞排列致密，胞核圆形，细胞内有较多分泌颗粒，粗面内质网较为发达(图2-7)。(2)病证模型组：光镜下可见腺垂体基质疏松，细胞核、细胞质边界不清，神经部基质疏松明显，细胞水肿(图1-5)。电镜下细胞间隙增大，细胞内有大量分泌颗粒，大部分线粒体空泡变，粗面内质网扩张明显(图2-8)。(3)药物干预组：光镜下基质疏松较轻，细胞轻度水肿(图1-6)。电镜下细胞排列紧密，部分线粒体空泡变，粗面内质网扩张减轻(图2-9)。

2.3睾丸观察结果(1)正常组：光镜下可见生精小管丰富，管壁薄、管径大，基膜明显、完整；生精上皮排列整齐，5～8层可见各级生精细胞及支持细胞；生精小管之间可见疏松的间质组织，富含血管及淋巴管，间质细胞成群分布，体积大，圆形或多边形，细胞核不规则，染色质较淡，胞质丰富(图1-7)。电镜发现精原细胞、支持细胞紧靠基膜且排列致密，支持细胞核仁明显，胞质基质密度均一，各类生精细胞层数较多，精母细胞核圆，线粒体丰富，精曲小管管腔内可见较多精子(图2-10)。(2)病证模型组：光镜下可见生精小管萎缩变形或扭曲成不规则形，管壁上生精细胞数量与精子数量明显少于正常对照组；间质细胞数量减少，核周围可见空泡(图1-8)。电镜下各级生精细胞数量明显减少，排列紊乱，可见有精原细胞、精母细胞核固缩，精子细胞界线模糊不清；支持细胞粗面内质网扩张(图2-11)。(3)药物干预组：光镜下可见生精小管丰富，基膜完整，生精上皮排列整齐，各级生精细胞明显增多，间质细胞成群分布，体积较大(图1-9)。电镜下生精细胞数量有所增多，支持细胞可见轻度水肿，管腔内精子数量明显增加(图2-12)。

1：正常组下丘脑神经胶质细胞(×10000) 2：病证模型组下丘脑神经胶质细胞(×10000) 3：药物干预组下丘脑神经胶质细胞(×10000) 4：正常组下丘脑神经元

5：病证模型组下丘脑神经元

9：药物干预组垂体

3 讨论

为了从现代生殖生物学角度进一步认识维医异常黏液质型阳痿,本课题组前期研究基于维医体液论和造模理念,成功建立了异常黏液质证候动物模型,并采用 APO 阴茎勃起实验与交配实验结合的方法,从中筛选出ED模型,对其生物学表征、性功能与交配行为、性腺轴与 NO-CGMP 信号转导通路等生殖生物学方面的改变进行了系统研究[4-6]。模型大鼠性腺轴相关激素水平的检测结果显示，其外周血清睾酮(T)水平显著降低，而促黄体生成素(LH)、催乳素(PRL)和雌二醇(E2)水平显著升高[7]，提示在该病证的发生发展中，性激素发生紊乱，并经对证维药伊木萨克片干预后得到有效调整，

生物学表征、勃起功能与交配能力均得到显著提升，该结果提示，性腺轴的神经内分泌改变可能在该病证的发生发展中起着关键性作用，而性腺轴可能是伊木萨克片对其治疗作用的关键靶点。

本研究在此基础上，观察了该病证的性腺轴形态学改变及对证维药伊木萨克片的影响。结果发现该病证模型组下丘脑出现血管扩张充血、基质疏松等改变，部分细胞核染色较浅，有空泡样病变，提示有水肿。电镜下神经胶质细胞基质密度明显下降，线粒体水肿呈空泡样病变，内质网轻微扩张；神经元核膜界线不清，核形不规则，异染色质增多，线粒体基质密度下降；腺垂体基质疏松，细胞核细胞质边界不清，神经部基质疏松明显，细胞水肿。电镜下细胞间隙增大，细胞内有大量分泌颗粒，大部分线粒体空泡样变，粗面内质网扩张明显。睾丸生精小管萎缩变形或扭曲成不规则形，各级生精细胞与层数明显减少，间质细胞数量减少，核周围有空泡。电镜下各级生精细胞数量明显减少，排列紊乱，可见有精原细胞、精母细胞核固缩，精子细胞界限模糊不清。支持细胞粗面内质网扩张。而经伊木萨克片干预后，下丘脑、垂体和睾丸的组织结构和细胞超微结构均得到不同程度的修复。该结果为以往研究中该病证的性腺轴相关激素的改变与伊木萨克片的调节机制提供了组织病理学与细胞形态学基础。

综上所述，性腺轴的组织、细胞形态学改变可能在异常黏液质型阳痿病证的发生发展中起着关键性作用，而性腺轴可能是伊木萨克片对其治疗作用的关键靶点。该药对性腺轴形态学的修复作用，可能是该药对异常黏液质型阳痿病证性腺轴相关激素紊乱的调节作用的组织与细胞学基础，但其具体机制与方式还需要进一步研究并予以验证。

参考文献：

[1] 中国医学百科全书编辑委员会.中国医学百科全书:维吾尔医学分册[M].上海:上海科学技术出版社,2005:20-124.

[2] 穆哈穆德爱扎木汗.医科思热爱扎穆[M].乌鲁木齐:新疆人民卫生出版社,2006:1622-1633.

[3] 穆塔力甫.维吾尔医成药学[M].乌鲁木齐:新疆人民卫生出版社,2006:355-357.

[4] 阿地力江·伊明,潘建春,哈木拉提·吾甫尔,等.几种不同方法建立维医异常黏液阳痿病证模型的研究[J]. 新疆医科大学学报,2010,33(11):1275.

[5] 阿地力江·伊明,范强,哈木拉提·吾甫尔,等.维医异常黏液质阳痿病证动物模型的建立与反证 [J].中国男科学杂志,2011,25(9):3-9.

[6] 阿地力江·伊明,范强,哈木拉提·吾甫尔,等.维医异常黏液质证候与阳痿病证大鼠性行为学改变的研究[J].中国男科学杂志,2011,25(9):20-23.

[7] 阿地力江·伊明,潘建春,哈木拉提·吾甫尔,等.维医异常黏液质证候与阳痿病证大鼠模型生殖激素的改变及其生物学意义[J].新疆医科大学学报,2012,35(11):1438-1444.