维药恰麻古总黄酮对D-半乳糖致衰老小鼠氧自由基代谢的影响

解 云， 康金森， 乌 英， 海力茜·陶尔大洪

(1新疆乌鲁木齐市友谊医院药学部， 乌鲁木齐 830000； 新疆医科大学2基础医学院， 3药学院药分/分析教研室 ， 乌鲁木齐 830011)

恰麻古植物学名为芜菁(BrassicarapaL.)，种子植物门双子叶植物纲十字花科(Cruciferae)芸苔属，芸苔种，芜菁亚种二年生草本植物，夏秋两季采收。来源为十字花科植物芜菁的干燥块根。药食同源，历史悠久。恰麻古具有很高的药用价值，始载于《名医别录》，味苦温，无毒。《维吾尔药志》记：性温，开胸顺气，健胃消食，解毒；用于胸闷腹胃胀痛、食欲不振、疮疖肿毒等疾[1]。衰老是机体各组织器官功能随年龄的增长而发生减退和稳态功能下降的过程。自由基学说是目前较为公认的衰老机制理论。人体内自身存在的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等抗氧化酶，均可以清除由活性氧和·OH诱发的脂质过氧化物，保护细胞膜结构和功能的完整性。现代药理研究证明新疆恰麻古提取物具有抗炎、止咳、平喘、抗氧化等作用[2]。本研究采用D-半乳糖致衰老小鼠模型，从氧自由基代谢方面研究恰麻古总黄酮的抗衰老作用，为恰麻古总黄酮用于延缓衰老或相关疾病治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂昆明种健康小白鼠60只，雌性，体质量18～22 g，SPF级[动物生产许可证号：SCXK(新)2011-0004，动物使用许可证号：SYXK(新)2011-0004]，由新疆医科大学医学实验动物中心提供。D-半乳糖(美国INALCO公司原装进口)，芦丁标准品(中国生物制品检定所，批号：100080-200707)，SOD(批号20130705)；GSH-PX、MDA及考马斯亮蓝测定试剂盒(批号20130705)均购自南京建成生物工程研究所。其他试剂均为分析纯。恰麻古药材产自阿克苏。RF-5301荧光分光光度计(日本岛津)，N-101旋转蒸发仪(上海爱朗)，分析天平(B-N梅特勒-上海托利多仪器有限公司)，型号AB-8、D-4020、D-101、D-141、SA-3共5种净品级大孔吸附树脂(天津制药厂)。

1.2实验方法

1.2.1 恰麻古总黄酮提取物的制备 取恰麻古药材粉末200 g，加75%乙醇800 mL，回流提取90 min，提取3次，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，加蒸馏水溶解，上D-101大孔吸附树脂，所得流出液弃去，用蒸馏水洗去杂质后，再用60%乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，移至500 mL容量瓶中，即得恰麻古药材总黄酮提取液。浓缩干燥成粉末，临用前用蒸馏水配成所需浓度。按已确定的恰麻古药材中总黄酮含量测定方法[3]，测得其总黄酮含量为7.57 mg/mL。

1.2.2 D-半乳糖致衰老小鼠模型的建立及给药[4-7]将小白鼠50只均衡随机分成5组：正常组、模型组、维生素E组及恰麻古总黄酮高、低剂量给药组，每组10只。适应性饲养1 w后，常规饲料喂养。除空白对照组外，其余4组每日上午均颈背部皮下注射D-半乳糖150 mg/kg，造模同时，高、低剂量给药组分别灌服恰麻古总黄酮90 、30 mg/kg，正常组和模型组灌服等容积的生理盐水，维生素E组按100 mg/kg灌服,每日1次，连续55 d。

末次给药24 h后，各组小鼠摘除眼球取血，4℃、3 000 r/min离心10 min制备血清；随后颈部脱臼处死，在冰袋上快速取肝脏和脑组织，并用冰冷生理盐水清洗后滤纸吸干，精密称量后制成10%的组织匀浆，4℃、4 000 r /min 离心10 min，取上清液；血清和组织匀浆样品冷冻保存于-20℃冰箱中，待测相关生化指标。

1.2.3 生化指标的测定 SOD的活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，GSH-PX的活性测定采用二硫代二硝基苯甲酸法，MDA的活性测定采用TBA反应比色法，蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。具体操作步骤严格按照试剂盒中使用说明书上程序进行操作。

1.3统计学处理采用SPASS 13.0统计软件包进行统计学分析，实验数据用均数±标准差(-x±s)表示,组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1动物的一般体征观察各实验组小鼠按实验设计连续处理8 w，每天除常规饲养外，进行一般体征观察。本实验中在连续给药2 w后，发现模型组小鼠嗜睡，不爱走动，进食量减少，个别小鼠出现掉毛现象；5 w后，嗜睡明显，长时间蜷缩不动，进食量显著减少，大部分小鼠均出现掉毛现象；7 w后，模型组小鼠行动明显迟缓，毛色暗淡，体型消瘦，出现了明显的衰老体征。

2.2恰麻古总黄酮对衰老小鼠脑组织中SOD、GSH-PX、MDA的影响与正常组小鼠比较，模型组小鼠脑组织中SOD、GSH-PX的活性明显降低(P<0.05)，MDA含量明显增高(P<0.05)，说明造模成功。与模型组小鼠比较，恰麻古总黄酮高剂量组及维生素E组小鼠脑内SOD活性明显增加(P<0.05)，GSH-PX活性明显增加(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.05)；低剂量组小鼠脑内GSH-PX明显增加(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.05),见表1。

2.3恰麻古总黄酮对衰老小鼠肝组织中SOD、GSH-PX、MDA的影响与正常组小鼠比较，模型组小鼠肝脏中SOD、GSH-PX的活性显著降低(P<0.05)，MDA含量显著增高(P<0.05)，说明造模成功。与模型组比较，恰麻古总黄酮高、低剂量组及维生素E组衰老小鼠肝脏中SOD、GSH-PX活性明显提高，MDA含量降低(P<0.05)，见表2。

2.4恰麻古总黄酮对衰老小鼠血清中SOD、GSH-PX、MDA的影响与正常组小鼠比较，模型组小鼠血清中SOD、GSH-PX的活性显著降低(P<0.05)，MDA含量显著增高(P<0.05)，说明造模成功。与模型组比较，恰麻古总黄酮高、低剂量组及维生素E组衰老小鼠血清中SOD、GSH-PX活性明显提高，MDA含量降低(P<0.05)，见表3。

表1 恰麻古总黄酮对衰老小鼠脑组织SOD、GSH-PX、MDA的影响(-x±s， n=10)

注：与正常组比较,*P<0.05 ;与模型组比较,▲P<0.05。

表2 恰麻古总黄酮对衰老小鼠肝脏SOD、GSH-PX、MDA的影响(-x±s， n=10)

注：与正常组比较，*P<0.05； 与模型组比较，▲P<0.05。

表3 恰麻古总黄酮对衰老小鼠血清SOD、GSH-PX、MDA的影响(-x±s， n=10)

注：与正常组比较，*P<0.05； 与模型组比较，▲P<0.05。

3 讨论

衰老是机体的生理功能逐渐下降最终走向死亡的过程，涉及机体多个系统和器官功能的退化[8]。1956 年，Harman提出了衰老的自由基学说，他认为衰老是由自由基引起的组织随机毒害的结果。在人的衰老过程中，神经元细胞膜上的不饱合脂肪酸被氧化而产生大量自由基，自由基可以损伤细胞膜、细胞器和酶的功能并使DNA发生突变。SOD 是体内清除氧自由基的关键酶，其活性间接反映了机体清除氧自由基的能力；GSH-PX是机体广泛存在的一种重要的催化H2O2分解的酶，起到保护细胞膜结构和功能完整作用，从而减缓衰老过程；MDA做为自由基作用于脂质发生过氧化反应的最终产物，其水平高低是指示氧化损伤和衰老的重要标志。

D-半乳糖致衰老模型是研究机体衰老的理想模型， 在国内外被广泛应用于衰老机制、老年病及抗衰老药物筛选等方面的研究[9-11]。本实验连续55 d给小鼠颈背部皮下连续注射D-半乳糖后，小鼠行动迟缓，毛色松散无光泽，自发性活动减少，且脑中SOD活力和抑制羟自由基能力比正常组均显著下降，而MDA含量比正常组均明显升高，说明衰老模型建立成功。本实验研究表明，恰麻古总黄酮可显著提高D-半乳糖所致衰老小鼠血清、脑和肝脏组织中SOD、GSH-PX活力，降低MDA含量，说明恰麻古总黄酮可通过清除衰老小鼠体内产生的过多自由基，抑制机体的脂质过氧化反应，延缓正常小鼠的自然衰老进程，具有一定的抗衰老作用。

本研究证实恰麻古总黄酮可提高体内自由基清除酶的活性，并减少脂质过氧化产物的生成，提示其具有抗氧化抗衰老作用，为将来其对和衰老相关的临床疾病治疗的开发应用提供了实验依据。其机制尚需深入研究。

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