摇蚊基因组DNA的提取方法研究

方响亮，彭 琴，伊剑锋，万 玮，傅 悦*

(1.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施 445000;2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院)，湖北恩施 445000)

作为现代生物系统学和生物进化学研究的热点方向之一，分子生物学的相关技术在鉴别动物物种、遗传多样性分析以及物种起源和进化等方面的研究中常被用到.目前，该技术已普遍应用到昆虫的相关研究上.基因组DNA的提取质量是开展后续分析检测工作的重要基础，为了成功从昆虫中提取到高质量的基因组DNA，前人就其提取方法进行过大量的研究.张大治等［1］运用CTAB法和蛋白酶K法(SDS法)提取蜻蜓基因组DNA，研究结果表明2种方法均较适宜.杨子祥［2］证明了利用平衡酚法提取蚜虫基因组DNA的可行性.张民照等［3］和葛风伟等［4］分别对直翅目昆虫的基因组DNA提取方法进行过研究，前者认为平衡酚法效果甚佳，后者则认为SDS法较好.代金霞等［5］、刘漩等［6］分别对拟步甲科昆虫的基因组DNA的提取方法进行探讨，前者的结果显示SDS法较可行，后者则得出CTAB法较有效.田英芳等［7］曾利用SDS法提取蟋蟀、螽斯、蝗虫、天牛和蜻蜓的基因组DNA，提取效果都较理想.印红等［8］采用改良的平衡酚法提取过果蝇、蝗虫、七星瓢虫和钝齿瑟虫的基因组DNA，其效果良好.通过前人的研究发现，用于昆虫基因组提取的方法主要包括基因组DNA提取试剂盒法SK8222、蛋白酶K法、SDS－苯酚法、平衡酚法、SDS法、CTAB法、NaCl法等.

摇蚊(Chirinomids)属于昆虫纲(Insecta)、双翅目(Diperta)、长角亚目(Nematocera)、蚊总科(Culicomorpha)、摇蚊科(Ceratopogonidae)，是一种世界性分布的水生昆虫，几乎遍及所有的淡水生境.常利用摇蚊幼虫进行水质监测、生态毒理学以及遗传毒理学等方面的研究.摇蚊成虫分类学方向的研究更受国内外学者的重视，长期以来运用形态特征进行分类，并取得了显著成果，随着分子生物学的发展，近几年摇蚊分子水平的研究逐渐受到重视.本研究分别使用上海生工生物有限公司提供的动物基因组DNA快速提取试剂盒法以及SDS法、CTAB法、NaCl法提取摇蚊的基因组DNA，进行效果比较，以期筛选出最适宜摇蚊科昆虫基因组DNA的提取方法，为摇蚊科昆虫分子生物学研究做好基础工作.

1 材料与方法

1.1 材料

试验所选摇蚊为成虫，于2014年4月采自湖北省恩施市湖北民族学院校园内，用85%乙醇浸泡保存.

1.2 试验仪器、用品及试剂

1.2.1 试验仪器 立式高压蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，电动组织研磨器(EQ6002，生工生物工程(上海)有限公司)，台式离心机(Centrifuge 5415R，Eppendof AG22331 Hamburg)，漩涡混合器(XW－80A，上海青浦沪西仪器厂)，恒温水浴锅(HHS型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，移液抢(Genex pipette)，微量紫外分光光度计(Thermo Scientific NANODROP 2000C)，掌上离心机(Scilogex D1008E，美国赛洛捷克)，PCR仪(Applied Biosystems 2720 Thermal Cycle)，电子天平(Sartorius BS2245，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，微波炉(格兰仕G70D20CSP－D2CS0)，电泳仪(DYY－10C型)和电泳槽(DYCP－31DN 型，北京市六一仪器厂)，凝胶成像仪(Universal HoodII，Bio－Rad Laboratories)，pH 计等.

1.2.2 试剂及药品 CTAB、异戊醇、DNA Marker(1kb)、琼脂糖，Tris、EDTA、SDS、NaCl、异丙醇，RNase A、蛋白酶K，Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、MgCl2、dNTP mixture Solution、动物基因组DNA快速抽提试剂盒SK8222、6×Loading Buffer、dd Water(生工生物工程(上海)股份有限公司)，无水乙醇(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)，苯酚、HCl(武汉市中天化工有限责任公司)、氯仿(武汉市江北化学试剂有限责任公司)、NaOH(武汉中南化工试剂有限公司)，COI引物 LCO 1490、HCO 2198，EB(BIO－BASIC INC).

1.2.3 试剂配制 SDS 提取液(50 mmol/L EDTA，1%SDS，100mmol/L Tris－HCl，0.5 mol/L NaCl，PH8.0);1 mol/L Tris－HCl(PH8.0)500 mL，500 mmol/L EDTA(PH8.5)500 mL，TE 缓冲液(1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris－HCl，PH8.0);蛋白酶 K(20 mg/mL，10 mg/mL);RNA 酶(10 mg/mL);20%SDS 溶液;5 mol/L NaCl溶液;STE 溶液(0.1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris－HCl(PH8.0);CTAB 提取液(2%CTAB，20 mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，100mmol/L Tris－HCl(PH8.0))，50×TAE buffer(2mol/L Tris－醋酸，100mmol/L EDTA).

1.3 基因组DNA的提取方法

第一组选取大小、外形一致的完整摇蚊成虫数只，分别选取2只放入1.5 mL的离心管中，共装4管，分别编号为1、2、3、4.第二组再另取4个1.5mL的离心管，每管装入1只摇蚊，分别编号A、B、C、D，按照以下4种方法提取摇蚊基因组DNA.

1.3.1 动物基因组DNA快速抽提试剂盒法(改良) 采用生工生物工程(上海)有限公司最新研制的动物基因组DNA快速抽提试剂盒SK8222.取预处理过的摇蚊标本，放到1.5 mL的离心管中，加入180 μL Buffer Digestion，用电动研磨杵充分研磨，加入20 μL蛋白酶 K(10 mg/mL)，20 μL RNA酶，震荡摇匀，56℃水浴过夜;加入200 μL Buffer PA，充分混合，置于－20℃冰箱放置5 min;将样品于室温下10000 r/min离心5 min，转移所得上清液(500～550μL)到已灭菌的新的1.5mL离心管中;加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温放置5 min，室温10000r/min离心5min，弃上清;加入600μL 75%乙醇，颠倒漂洗1～3min，10000r/min离心2min，弃上清，重复此步骤一次;室温开盖倒置5～10 min，至没有明显的乙醇气味即可;得到的DNA用25 μL TE Buffer溶解.提取的DNA置于－20℃保存.

1.3.2 改良的SDS法 参考王茜［9］提取摇蚊基因组DNA的方法.取预处理过的摇蚊标本，加100 μL SDS提取液，用电动研磨杵研碎，后用500 μL提取液冲洗枪头;加20 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，20 μL RNA酶，混匀后置于56℃水浴过夜(时间充裕的话每隔20～30 min在漩涡混合器上混合30 s);加300 μL Tris饱和酚、300 μL氯仿:异戊醇(24∶1)，抽提DNA，12000r/min离心10min，取上清;加入与上清等体积的氯仿:异戊醇(24∶1)，12000 r/min离心10 min，取上清;加等体积的异丙醇于－20℃中沉淀DNA 2～3 h，12000 r/min离心15 min，弃上清;加600 μL 70%乙醇，洗涤DNA，12000 r/min离心15 min，弃上清，重复此步骤1次;浓缩干燥后加25 μL TE，溶解DNA，置于4℃保存备用.

1.3.3 改良CTAB法 参考王茜［9］提取摇蚊基因组DNA的方法.取预处理过的摇蚊，加100 μL CTAB提取液，用电动研磨杵研碎，后用500 μL提取液冲洗枪头;加20 μL蛋白酶K(10 mg/mL)、20 μL RNA酶，混匀后置于56℃水浴过夜(时间充裕的话每隔20～30min在漩涡混合器上混合30s);加300μL Tris饱和酚、300μL氯仿:异戊醇(24∶1)，抽提DNA，12000 r/min离心10 min，取上清;加入与上清等体积的氯仿:异戊醇(24∶1)，12000 r/min离心10 min，取上清;加等体积的异丙醇于－20℃中沉淀DNA 2～3 h，12 000 r/min离心15 min，弃上清;加600 μL 70%乙醇，洗涤DNA，12000 r/min离心15 min，弃上清，重复此步骤1次;浓缩干燥后加25 μL TE，溶解DNA，置于4℃保存备用.

1.3.4 改良NaCl法 参考王茜［9］提取摇蚊基因组DNA的方法.取预处理过的摇蚊，加200 μL STE，用电动研磨杵研碎;加45～50μL SDS，4～5μL RNA 酶，37℃消化1h;加蛋白酶K 4～5μL(20mg/mL)，56℃消化过夜;加5mol/L NaCl 300μL，在漩涡混合器上高速混合30s，10000r/min离心30min，取上清;加等体积的异丙醇于－20℃中沉淀 DNA 2 h，10000 r/min 离心15 min，弃上清;加600 μL 70%乙醇，洗涤 DNA，12000 r/min 离心15 min，弃上清，重复此步骤1次;浓缩干燥后加25 μL TE，溶解DNA，置于4℃保存备用.

1.4 基因组DNA质量检测

观察每种处理的DNA沉淀的性状.在微量紫外分光光度计上做DNA的产量和质量分析;然后进行琼脂糖电泳检测.

1.4.1 微量紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度 吸取2 μL样品DNA溶液，直接滴在微量紫外分光光度计的上样孔处，在蛋白核酸分析仪上测定其在260 nm和280 nm处的消光值(OD值).通过OD260/OD280的比值计算DNA样品的纯度.

1.4.2 PCR－COI 以LCO 1490、HCO 2198作为引物，摇蚊基因组DNA为模板对摇蚊COI基因进行扩增，PCR 扩增反应体系总体积为 25 μL.其中 10×PCR buffer 2.5 μL，LCO primer 0.5 μL ，HCO primer 0.5 μL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，MgCl22.0μL，Taq DNA polymerase 0.15μL，摇蚊 DNA 1.0μL，dd water 17.85μL.PCR扩增反应条件为:95℃预变性5 min;94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共24 cycles;最后72℃延伸5 min，7℃保存.

1.4.3 PCR产物检测 配置浓度为l%的琼脂糖凝胶50 mL，加热直至完全溶解.待胶冷却至60℃左右时，将胶倒入胶槽中，常温下冷却10～20 min左右，使胶凝固后拔去梳子将其推入装有1×TAE的电泳槽中，胶孔朝向负极，液面约淹没胶面1mm左右.将6×Loading Buffer 1μL与5μL的PCR扩增样品用移液抢充分混匀，第一孔点入 2 μL DNA Marker，第二孔点入5μL混匀的DNA样品，而后在输出电压80V下电泳45min最后在凝胶成像分析系统中观察结果并照相.

表1 第1组编号1、2、3、4样品DNA的OD值及检测浓度Tab.1 OD values and detective density of No.1，2，3，4 DNA samples of group I

2 结果及分析

2.1 紫外分光光度计法检测

第1组中每个样品检测两次取平均值，检测结果见表 1.一般认为，OD260/OD280值在1.6～1.8时DNA较纯;大于1.8，说明样品中 RNA未除尽;小于1.6，说明样品中含有蛋自质.从检测结果可以看出，这4种方法均可获得一定量的DNA，但是不同方法提取的DNA质量有明显差异，见表1.前三种方法所提取的DNA比值都大于1.8，说明所获得的DNA中遗留有较多RNA.而NaCl法提取的DNA比值低于1.6，说明所测DNA样品中蛋白质未除尽.前三种方法中SDS法所得样品OD260/OD280比值最接近1.8，说明此法获得的DNA相对于其他方法纯度更高一些.在所测DNA样品浓度一栏中，可知浓度由高到低依次为试剂盒法、CTAB法、SDS法、NaCl法.

第2组每个样品检测三次取平均值.其结果见表2.由下表可知，只有SDS法所得DNA A260/A280值平均值在1.6～1.8，说明所得 DNA 纯度较高，试剂盒法、CTAB法中比值皆大于1.8，说明有大量 RNA存在，NaCl法所得明显小于1.6，说明其中含有蛋白质等杂质.但CTAB法所得DNA浓度最高，其后为试剂盒法，SDS法，NaCl法所得依然最少.

第1组每个离心管中DNA样品由2只摇蚊所提取得到，第2组每个离心管中DNA样品由1只摇蚊所提取得到，从表3可看出试剂盒法和SDS法所提DNA两组比例接近2∶1，符合所用样品的数量比，而CTAB法两组比例接近1∶1，NaCl法中第2组浓度甚至大于第1组.

2.2 电泳法检测结果

电泳结果见图1.第一组4个样品编号为 1、2、3、4，第二组 4 个样品编号为A、B、C、D，分别依次用试剂盒法、SDS法、CTAB法、NaCl法提取DNA;从图1可知，4种方法均可提取出DNA.DNA Marker与扩增片度都有一定的拖尾现象，这可能部分原因与电泳条件和琼脂糖凝胶有关，除此之外，基于不同DNA提取方法的拖尾现象有不同程度的差异，如第一组CTAB法和SDS法提取的DNA条带窄小但清楚、完整，推测这两种方法所提DNA完整且纯度较高，表1数据显示试剂盒法提取DNA纯度也较高，但显示拖尾，推测DNA有断裂现象;而NaCl法所提取的DNA条带相对拖尾明显，根据表1显示该方法提取DNA纯度不高，推测主要可能因含有较多杂质如蛋白质、多糖等导致其纯度不高.第2组中，试剂盒法、SDS法、CTAB法所得条带都较明亮但皆有拖尾现象，又因依据表2，这三种方法提取DNA纯度较高，推测拖尾现象可能因DNA断裂引起或由于第二组选取样品种类不同导致COI引物特异性不同;NaCl法条带模糊，无拖尾现象，推测COI引物在该种中特异性较高.

综合以上分析可知，提取摇蚊基因组DNA的方法中，依据紫外分光光度计法检测结果，得到产物纯度由高到低依次为SDS法、试剂盒法、CTAB法、NaCl法，浓度由高到低依次为试剂盒法、CTAB法、SDS法、NaCl法.综合考虑，提取摇蚊基因组DNA的最佳方法是试剂盒法，其次为CTAB法和SDS法.依据电泳法检测结果得出，4种方法提取的DNA的浓度都能扩增出特异的COI基因片段.

表2 第2组编号A、B、C、D样品DNA的OD值及检测浓度Tab.2 OD values and detective density of No.A，B，C，D DNA samples of group II

表3 第1组、第2组所得DNA样品浓度比较Tab.3 The comparison of DNA sample’s density of group I between group II

图1 PCR－COI琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 The picture of agarose gel electrophoresis of PCR results

3 讨论

本研究用4种方法提取摇蚊基因组DNA浓度和纯度的比较主要依据第1组实验数据(表1)，因为该组选取的4种样品来自同一采集地和采集时间的婚飞群体，即同一物种，具有较好的可比性;第2组选取的4个样品个体大小、形态特征明显不同，通过该组的数据(表2)进一步验证了4种方法提取的DNA的纯度高低与第1组结论一致，但该组数据得出的浓度无可比性.

本研究，第1组每个样品选取了2头摇蚊，第2组每个样品选取1头摇蚊，个体大小、数量与DNA浓度有一定的相关性，因此两组的DNA浓度进行了进一步比较，见表3，根据选取个体数量不同，第1组(2头标本)浓度应高于第2组(1头标本)，甚至第1组浓度可能为第2组的2倍.但由表3可知，只有试剂盒法和SDS法符合这个比例，CTAB法和NaCl法都存在反常情况，分析原因可能是由于选材时由于存在种类差异的所造成的:第1组选材时特别注重了选取同一种类，以便减少误差，突出提取方法的差异;而第2组选材时，一方面是受到实验材料的限制，造成选取种类大小不一，另一方面是为了验证摇蚊个体大小差异对DNA提取浓度或纯度的影响.

本实验采用的方法皆在多次实验基础上做过改良，其中试剂盒采用生工生物工程(上海)有限公司最新研制的动物基因组DNA快速抽提试剂盒SK8222，本研究过程中利用该试剂盒做过多次尝试，都未能提取到理想的DNA条带.因此将原方法的65℃水浴1～3 h改为56℃水浴过夜，使组织彻底裂解释放出DNA，而对于是否额外添加蛋白酶K则可视具体实验要求添加而不会对提取DNA造成大的影响，第1组试剂盒方法中额外添加蛋白酶K，而第2组试剂盒方法中按照标配操作，未额外加蛋白酶K;同时为了保证提取DNA的浓度，在溶解时改为用25 μL TE Buffer溶解.其他几种方法参考王茜［9］的论文，同样经过笔者多次实验探究都未能获得理想结果，因此在原方法(水浴2～3 h)的基础上采用水浴过夜处理，过夜水浴加长了裂解时间，能够使样品充分裂解，有利于释放DNA，同时加大了蛋白酶K的用量，有利于消除蛋白质对于DNA提取的影响.

本实验采用摇蚊COI引物对摇蚊COI基因进行PCR扩增后再用琼脂糖电泳检测，一方面可以对所提DNA的质量进行检测，另一方面也为分子生物学所用到的基因片段后续工作打好基础.

［1］张大治，戴沛捷.蜻蜓目昆虫DNA的提取方法研究［J］.宁夏农学院学报，2004，25(3):10－12，27.

［2］杨子祥，冯颖，陈晓鸣.一种有效的蚜虫基因组DNA提取方法［J］.林业科学研究，2005，18(5):641－643.

［3］张民照，康乐.飞蝗总DNA的提取和RAPD分析条件的摸索［J］.动物学研究，2001，22(1):20－26.

［4］葛风伟，季荣，曾献春，等.西伯利亚蝗基因组DNA提取及RAPD分析条件的优化［J］.昆虫知识，2007，44(4):505－507.

［5］代金霞，于有志，郑哲民.拟步甲昆虫基因组DNA提取的比较研究［J］.宁夏大学学报:自然科学版，2004，25(1):66－68.

［6］刘漩，张富春，马纪.一种提取荒漠拟步甲昆虫基因组DNA的新方法［J］.干旱区研究，2009，26(4):582－583.

［7］田英芳，黄刚，郑哲民，等.一种简易的昆虫基因组DNA提取方法［J］.陕西师范大学学报:自然科学版，1999，27(4):82－84.

［8］印红，刘晓丽，王彦芳，等.一种改进的昆虫基因组DNA的提取方法［J］.河北大学学报:自然科学版，2002，22(1):80－82.

［9］王茜.直突摇蚊亚科高级阶元的分子系统学研究(双翅目:摇蚊科)［D］.天津:南开大学，2011.