高效液相色谱法同时测定连翘叶中连翘酯苷A和连翘苷含量

姬雪礼，李文烈，郑晓杰，马艳玲

（石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050035）

连翘 Forsythia suspensa（Thunb．）Vahl是木犀科植物连翘属落叶灌木，其果实为常用中药材，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效[1]，尤其是解热、抗菌、抗病毒作用显著。连翘叶中的某些有效成分含量高于连翘果实，具有明显的抗氧化、抗衰老等作用[2-5〛，部分地区常用连翘嫩叶制成连翘叶茶饮用，具有较好的保健价值。连翘苷和连翘酯苷A为连翘叶中的主要有效成分，因此本试验中以连翘酯苷A和连翘苷为指标[6-7]，建立了快速、准确、稳定、可靠的可同时测定两者含量的高效液相色谱（HPLC）法，以期为连翘叶资源的开发提供科学依据，现报道如下。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪，包括2695 Separations Module，2998 Photodiode Array Detector，Empower 2 Software Build 2154 工作站。连翘酯苷A对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111810-201102，供含量测定用，含量为 93．2%）；连翘苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号为110821-200610）；连翘叶（石家庄以岭药业股份有限公司，批号为 20120501，20120901，20120902，20121101)；超纯水（Milli-Q Advantage A10 超纯水系统），甲醇（Fisher，色谱纯）；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（150 mm × 4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0．1% 磷酸溶液（32 ∶68）；流速：1．0 mL ／min；检测波长：227 nm；柱温：30℃。理论板数按连翘酯苷A峰计算应不低于 5 000，色谱图见图1。

2．2 溶液制备

精密称取连翘酯苷A对照品及连翘苷对照品各适量，分别加70%甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液，作为对照品溶液。取样品粉末（过四号筛）约0．2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)15 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，0．22 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。取70%甲醇溶液作为空白对照品溶液。

2．3 方法学考察

专属性试验：分别吸取连翘酯苷A对照品溶液、连翘苷对照品溶液、供试品溶液和空白对照品溶液各适量，按拟订色谱条件进样检测。结果阴性无干扰，连翘酯苷A峰、连翘苷峰与其他峰分离良好(图1)。

线性关系考察：分别精密吸取质量浓度为29．317 0，58．634 0，73．292 5，146．585 0，219．877 4，366．462 4 μg ／mL 的连翘酯苷 A对照品溶液各 10 μL，和质量浓度为 33．376 0，66．752 0，83．440 0，166．880 0，250．320 0，417．200 0 μg ／mL 的连翘苷对照品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件测定峰面积，以连翘酯苷 A和连翘苷的进样量（X，ng）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程 Y连翘酯苷A＝1281．3706X＋4256．8182（r＝0．999980），Y连翘苷＝2034．5969X-10 608．267 0（r＝ 0．999 991）。结果表明，连翘酯苷 A 和连翘苷进样量分别在 293．170 ～3 664．624，333．760～4 172．000 ng 范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验：分别取连翘酯苷A对照品溶液和连翘苷对照品溶液（含连翘酯苷 A 73．292 5 μg ／mL，连翘苷 83．440 0 μg ／mL），连续进样6次，每次10 μL。结果连翘酯苷A和连翘苷峰面积的RSD分别为0．47%，1．14%，表明仪器精密度好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10 μL，室温放置，分别于 0，4，8，12，16，24，40 h 时进样测定。结果连翘酯苷 A 和连翘苷峰面积的 RSD分别为2．12%，0．91%，表明供试品溶液在40 h内稳定。

重复性试验：取同一批样品（批号为 20120501），分别取0．16，0．20，0．24 g 3 个样品量，每个样品量 3 份，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果测得连翘酯苷A 的平均质量分数为 20．860 1 mg／g（n＝9），连翘苷的平均质量分数为 19．178 7 mg／g（n ＝ 9），RSD 分别为 1．54% ，1．01% ，表明方法重复性好。

加样回收试验：取同一批样品（批号为20120501）9份，每份0．1 g，精密称定，分别加入高、中、低3个质量浓度的连翘酯苷A和连翘苷对照品70%甲醇溶液50 mL，依法平行制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝9）

2．4 样品含量测定

取不同批次连翘叶粉末，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，以外标法峰面积计算样品中连翘酯苷A和连翘苷的量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）

3 讨论

本试验中色谱条件参考了2010年版《中国药典（一部）》中“连翘”药材含量测定项下的色谱条件，曾采用乙腈-0．4%冰醋酸（15 ∶85，17 ∶83，16 ∶84）、甲醇 -0．4% 冰醋酸（40 ∶60）为流动相，结果连翘酯苷A分离效果不好，后采用甲醇-0．4%冰醋酸（35 ∶65，30 ∶70）及甲醇 - 乙腈 -0．4% 冰醋酸（5 ∶15 ∶80）分离效果仍不理想。采用甲醇 -0．1%磷酸溶液（35∶65）为流动相，经调整流动相的比例，以甲醇 -0．1%磷酸溶液（32∶68）为流动相，连翘酯苷A色谱峰分离较好，色谱峰保留时间较合适，并且连翘苷色谱峰分离度也好。

对连翘酯苷A和连翘苷对照品溶液进行光谱检测，结果连翘苷在 200，227，276 nm波长处有强吸收，连翘酯苷 A在200，217，328 nm波长处有强吸收。为简化操作，同时考虑连翘酯苷A与连翘苷吸收峰面积及杂质峰的影响，采用227 nm为测定波长。

试验结果表明，所建立的方法简单，操作方便，专属性强、重复性好、结果可靠，可用于同时检测连翘叶中的连翘酯苷A和连翘苷成分，为连翘叶资源开发提供了参考依据。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：159-160．

[2]张 杲．连翘叶药用价值及其药用活性组分的初步研究[D]．西安：陕西师范大学，2006．

[3]李发荣，段 飞，杨建雄．中药连翘及连翘叶中连翘苷含量的比较研究[J]．西北植物学报，2004，24（4）：725-727．

[4]杨建雄，朱淑云，李发荣．连翘叶茶的体外抗氧化活性[J]．食品科学，2002，23（12）：120-123．

[5]耿慧君，王文科，毕润成．连翘叶的体外抗氧化活性研究[J]．山西师范大学学报：自然科学版，2005，19（4）：71-73．

[6]陈日来，李玉珍，李衡梅，等．高效液相色谱法同时测定双黄连口服液中连翘酯苷 A和连翘苷[J]．中国医院药学杂志，2007，27（3）：420-421．

[7]蔡 颖．HPLC法测定小儿肺热咳喘口服液中连翘苷和连翘酯苷A的含量[J]．齐鲁药事，2012，31（6）：333-334．