2种方法制备靶向超声微泡对卵巢肿瘤新生血管评价的意义

杨钦涵， 罗 慧， 向 红

(新疆医科大学第一附属医院妇产超声诊断科， 乌鲁木齐 830054)

靶向超声造影技术是目前世界范围内的前沿性课题，随着超声造影技术的不断革新，临床诊疗与超声影像学逐渐接轨并取得了跨越式发展。靶向微泡构建的核心技术是如何配体连接到微泡表面，其连接效果会直接影响靶向微泡的稳定性。常用的微泡连接方法有直接(共价)连接法或间接连接法中的生物素-亲和素桥连接法[1]。随着第三代靶向超声造影剂的兴起，妇科超声用其诊断卵巢恶性肿瘤亦步入实验探索阶段。卵巢癌起病隐匿，其发生、发展依赖瘤体内新生血管的形成。在肿瘤新生血管内皮表面,血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor2, VEGFR2)大量表达。因靶向超声微泡(MBt)表面可与配体特异性地结合并聚集于感兴趣区，提高病变检出率且增强组织显影，所以本研究将VEGFR2作为靶向超声特异性分子，采用直接连接法和生物素-亲和素桥连接法分别制备携VEGFR2单抗的MBt，通过对比裸鼠卵巢癌移植瘤的造影成像特点，评价2种制备MBt 方法的优缺点。

1 材料与方法

1.1实验动物裸小鼠(SPF级)18只，雌性，品系：BALB/c-Nude，6～8周龄，体质量18～20 g，由北京维通利华生物科技有限公司提供。

1.2主要实验材料与仪器SonoVue(意大利博莱科公司)，磷酸缓冲液PBS(美国Gibco公司)，生物素化大鼠抗小鼠VEGFR2单克隆抗体(美国ebioscience公司)，链霉亲和素(美国Sigma公司)，生物素化脂质 DSPE-PEG(2000)Biotin(美国Invitrogen公司)，人卵巢癌细胞株SKOV3(购自北京北纳创联生物技术研究院)，1640完全培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)，兔抗多克隆抗体(美国Invitrogen公司)，FITC标记山羊抗大鼠IgG(北京中杉金桥)，山羊抗兔IgG(北京中杉金桥),DAB显色液(北京中衫金桥)，二氧化碳培养箱，百胜MyLab90彩色超声仪(探头型号LA522、3～9MHz)，低温离心机，恒温水平摇床，光学显微镜，荧光显微镜。

1.3人卵巢癌细胞株SKOV3细胞培养人卵巢癌细胞株SKOV3细胞，生长方式为贴壁生长。采用含10%胎牛血清、100 μg/mL的青霉素和链霉素的1640完全培养液，在37℃的CO2培养箱培养。

1.4建立裸小鼠皮下移植瘤模型[2]将卵巢癌SKOV3细胞株传代培养至7～8代时提取细胞，将细胞经0.125%胰蛋白酶消化后，用胎牛血清1640培养液漂浮洗涤，使活细胞浓度调至5×107个/mL，充分混匀，在每只裸鼠背部皮下接种0.2 mL，次日接种记为为第1天，每只接种1点，待所有荷瘤鼠肿瘤长径>1 cm时行超声造影检查。

1.5制备携VEGFR2单抗靶向超声微泡普通造影剂选用SonoVue，为磷脂稳定的六氟化硫微泡造影剂。(1)直接连接法制备MBt: 取1支SonoVue，加入磷酸盐缓冲液(PBS)2 mL,30 s匀速震荡混匀。按照1∶100加入生物素化大鼠抗小鼠VEGFR2单克隆抗体，充分混匀(室温环境)，调其混悬液的pH值至4.5，4℃下静置2 h，自然分层后取上浮液，PBS反复漂浮洗涤3次，即得到携VEGFR2单抗的靶向微泡，于4℃环境下保存备用。 (2)生物素-亲和素桥连接法制备MBt: 取1支SonoVue，加入磷酸盐缓冲液1 mL,30 s匀速震荡混匀。生物素化脂质按照150 μg/mL 的浓度加入，4℃恒温轻摇反应1 h，4℃下离心1 min(500 r/min)后静置15 min，使离心管内的乳白色微泡混悬液分层，下层澄清液体用注射器缓慢抽去，保留乳白色微泡层，漂浮洗涤2次，即得到生物素化修饰的微泡。与特异性抗体的连接[3]:向每1×107个微泡加人链霉亲和素3 μg，充分混匀后，在4℃下避光静置30 min，弃下清液，微泡漂浮洗涤2次。按照1∶100的浓度加入生物素标记的特异性抗体，充分混匀后，在4℃下静置30 min，弃下清液，漂浮洗涤微泡2次，即得到携VEGFR2单抗的靶向微泡，于4℃环境下保存备用。

1.6免疫荧光法检测MBt分别取2种方法制备的MBt1 mL，按照1∶100浓度，在避光环境下，加入FITC标记山羊抗大鼠IgG，充分混匀后，静置30 min，4℃下离心1 min(500 r/min)，弃下清液。漂浮洗涤微泡2次。弃下清液以除去游离二抗，将微泡涂片，于荧光显微镜下观察荧光情况。

1.7超声造影检查无菌条件下，麻醉动物，使用百胜My Lab90彩色超声仪。裸鼠取俯卧位，涂抹适量耦合剂于裸鼠背部皮肤肿瘤突起处。超声造影前先行二维及彩色多普勒模式，记录肿瘤大小、形态、内部回声，保存静态图像。选择最大切面转入对比脉冲序列(contrast pulse sequence，CPS)造影模式。保持探头机械指数0.08，发射频率为4 MHz，记录帧频8 Hz。将18只裸鼠随机分为两组，先分别随机注射2种方法制备的MBt，对2种方法制备的MBt进行比较。间隔60 min之后，再将18只裸鼠注射MBc，对各组内MBt与MBc进行比较。分别观察2种制备方法的MBt及各组内MBt与MBc的裸鼠卵巢癌移植瘤新生血管的造影特征。每只裸鼠分别经尾静脉注射 0.2 mL的微泡混悬液，微泡数为5×106个。详细做好实验记录，保存全程动态影像。通过Qontrast超声造影软件分析造影检查时间强度曲线的相关参数：即持续时间、峰值强度(peak intensity,PI)。

1.8病理学检查造影结束即刻处死裸鼠，取出瘤体经4%多聚甲醛溶液固定，免疫组化法检测肿瘤组织内VEGFR2表达，结果判定则以肿瘤组织血管内皮有大量条索状棕黄色为阳性。

1.9统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，因计量资料不符合正态分布，故以中位数M(P25，P75)表示，TIC参数间比较采用两组计量资料的秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1SKOV3肿瘤细胞裸鼠模型情况SKOV3细胞株接种3 w，18只裸鼠背臀部均长出直径>1 cm的实性肿块，表面光滑，均无破溃出血(图1)，两组裸鼠移植瘤体积分别为(0.35±0.04)、(0.38±0.04) cm3。

2.2免疫荧光法检测2种方法制备的MBt在荧光显微镜下，2种方法制备携VEGFR2单抗的MBt分别与FITC标记山羊抗大鼠IgG孵育后，微泡表面发出绿色荧光，说明FITC标记的山羊抗大鼠IgG与靶向微泡表面连接的抗体特异性结合(图2、3)。

图1裸鼠接种SKOV3细胞株3w，背臀部长出实性肿块图2直接连接法荧光显微镜下的MBt(×200)图3生物素-亲和素桥连接法荧光显微镜下的MBt(×200)

2.3肿瘤超声图像分析及造影结果将MBt与MBc经尾静脉注入裸鼠体内均可见瘤体中的新生血管，从瘤体较深面向表面形成分支，造影剂均从瘤体周边向中央快速充盈，至瘤体全面强化(图4)。生物素-亲和素桥连接法制备的MBt较直接连接法制备的MBt持续显像时间更长(P<0.05)，峰值强度更高(P<0.05)；各组内MBt与MBc之间TIC曲线分析比较，两组组内MBt均较MBc造影剂持续显像时间更长(P<0.05)，峰值强度更高(P<0.05)(表1)。

2.5病理结果肿瘤组织经HE染色证实为卵巢癌，免疫组织化学显示：肿瘤新生血管内皮见大量棕黄色VEGFR2阳性表达(图5)。

表1 2种方法MBt与MBc组内造影TIC定量参数的比较 [M(P25，P75)]

注：与直接连接法组比较，*P<0.05。

图4 造影剂充盈瘤体并全面强化

图5 免疫组织化学：肿瘤血管内皮VEGFR2(棕黄色颗粒)阳性表达(×400)

3 讨论

本研究以第二代超声造影剂声诺维(SonoVue)作为微泡的构建基础并采用直接连接法和生物素-亲和素桥连接法制备MBt。本研究发现，生物素-亲和素桥连接法制备的MBt较直接连接法制备的MBt峰值强度高，造影检查持续显像时间更长，这一点证实了生物素-亲和素桥连接法令靶向微泡的超声造影显像效果更好。直接连接法因不添加任何化学成分，通过自身的静电吸附作用直接将靶向配体连接于微泡上，故此法微泡与配体结合程度低，电荷吸附不牢固，且在体内随血液循环易于脱落。而生物素-亲和素桥连接法制备MBt的成膜材料即生物素化脂质DSPE-PEG(2000)Biotin，它不但将生物素化基团引入到微泡表面，且本身的聚乙二醇长臂使生物素基团与微泡表面锚点的距离增大，使配体灵活运动，靶向基团可有效地连接在微泡表面[4]。另一重要成分是链亲和素，它与生物素结合力极强，能够将任何种类的生物素化配体连接到微泡表面，且酸、碱、变性剂均不影响其结合，尤其适合生物医学各方向的研究[5]。MBt制备中发现，其稳定性极其易受离心力、温度及试剂剂量比例等因素的影响，所以要严格控制好每一步操作，并且靶向微泡制备完成应尽快使用，避免长久搁置。近几年，随着靶向超声微泡进一步研究，新型靶向微泡也制备成功，Warram等[6]制备出多配体MBt，且发现多配体微泡与细胞黏附数量明显多于单配体、双配体，在肿瘤显像效果方面明显优于单配体和双配体。

本研究发现各组内MBt较MBc微泡持续显像时间更长且峰值强度更高。这是与靶向超声微泡其表面连接有与肿瘤新生血管表面大量表达的特异性血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有关，它是在肿瘤早期形成的特异性生长因子，能促使肿瘤的发生、发展[7]。Fujimoto等[8]发现，VEGF在卵巢恶性肿瘤中异常高表达。Anderson等[9]将携有VEGFR2单克隆抗体的MBt注入荷瘤小鼠体内，发现肿瘤新生血管区域图像分辨力显著提高。在普通超声微泡表面未结合特异性抗体，缺乏对靶组织特异性亲和力，故不能够在靶组织停留较长时间。而靶向微泡表面结合有VEGFR2单克隆抗体，所以能与卵巢肿瘤组织血管内皮上高度表达VEGFR2的特异性靶点相结合。Linder等[10]经活体显微镜观察发现，在微血管内皮上，靶向超声微泡紧密黏附其上，不易经循环代谢清除。由于靶向微泡可较长时间驻留于靶组织，因此在肿瘤内部血管观察、靶向传送抗癌及抗血栓药物等方面均有效果。Lin等[11]报道靶向微泡可以携带药物，将抗癌药物直接运送至肿瘤新生血管内的癌细胞，这样可以在早期控制肿瘤生长。本实验免疫组织化学结果验证了携带VEGFR2单抗的靶向微泡直接与肿瘤组织血管内皮特异性结合。

综上，本研究通过使用2种方法成功地制备携VEGFR2单抗的靶向微泡，在卵巢癌移植瘤超声造影显像及微泡稳定性方面，生物素-亲和素桥连接法制备的靶向微泡效果更优于直接连接法，也证明MBt较MBc的超声造影显像效果更好，为无创性评价肿瘤新生血管开创了新的思路。随着MBt研究不断发展，必将会研制出稳定性、靶向性更好造影剂，为临床诊疗带来新希望。

参考文献：

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[11] Lin CY, Tseng HC, Shiu HR, et al. Ultrasound sonication with microbubbles disrupts blood vessels and enhances tumor treatments of anticancer nanodrug[J]. Int J Nanomedicine, 2012, 7:2143-2152.