生物絮凝高活性菌株筛选及发酵优化

彭桂香，卢秋雁，孔慧清，李 雄，万 涛，卢钰升，谭志远

(1 广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室/华南农业大学 资源环境学院，广东 广州510642;2 广东天辰生物技术有限公司，广东 广州510070;3 华南农业大学 农学院，广东 广州510642)

凡能使水溶液中的溶质、胶体或悬浮颗粒产生絮状沉淀物的物质叫絮凝剂［1-2］.按照药剂使用化合物的类型，絮凝剂可分为无机絮凝剂、有机絮凝剂和生物絮凝剂3 大类［3］.在絮凝技术发展史上，无机盐类絮凝剂(如含有铝离子的无机盐类絮凝剂)一方面毒害水生生物和微生物;另一方面通过食物链和饮用水最终危害人类健康［4-5］.有机合成高分子絮凝剂聚丙烯酰胺(Polyacrylamide，PAM)具有用量少、絮凝速度快的优点，但残留物不易被生物降解，且其单体有强烈的神经毒性和“三致”效应(致畸、致癌、致突变)，造成二次污染，也限制了它的应用［6-9］.

微生物絮凝剂是一类由微生物产生的代谢产物，主要成分有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA等［10-11］.可以通过微生物发酵、提取、精制而得，具有生物分解性和安全性，是新型、高效、无毒、无二次性污染的水处理剂.它具有广谱的絮凝活性、可生物降解及应用安全性，显示了它在废水脱色、含高悬浮物的废水处理、乳浊液的处理、畜产废水的处理、活性污泥的处理、食品加工和发酵工业等方面的应用前景，已经成为国内外新型水处理剂研究和开发的热点［12-17］.但是目前对微生物絮凝剂的应用研究多处于实验室阶段，还未见大规模的工业化应用［18-20］.

本研究根据耕作后药用野生稻水稻田比栽培稻水稻田能够很快变得澄清这一现象，从野生稻中分离出1 株具有开发和应用潜力的高絮凝活性的微生物絮凝剂产生菌.以高岭土悬浊液为处理对象，对它的生长及产微生物絮凝剂的影响因素进行探索，掌握其产微生物絮凝剂的最佳条件，研究其高效的絮凝特性，为微生物絮凝剂的研制开发提供基础理论和应用依据.

1 材料与方法

1．1 菌株来源和培养基

菌株是从华南农业大学试验地药用野生稻Oryza officinalis 植株分离而来，共分离到135 个菌株.筛选到的絮凝活性高的菌株参考Peng 等［21方法进行16S rRNA 基因扩增及序列分析.

采用VM 固体培养基活化菌株，VM［21］液体培养基作为絮凝剂产生菌的筛选培养基.其中固体培养基中加入终质量浓度为20 g·L-1的琼脂.

1．2 絮凝剂产生菌的筛选及活性测定

将分离后保藏的135 个菌株用平板划线法接入VM 固体培养基上，培养24 h，用接种环从平板上挑一环活化后的菌株接种到装有50 mL VM 培养液的250 mL 三角瓶中，将三角瓶置于恒温振荡器中，30℃、180 r·min-1培养24 h 后测定各菌株培养液对高岭土悬液的絮凝活性.

用絮凝率来定量表征絮凝活性，在150 mL 三角瓶中加入高岭土0.5 g，再加入100 mL 蒸馏水，配成质量浓度为5 g·L-1的高岭土悬液，加入1 mL 细菌培养液［细菌培养液浓度用紫外分光光度计UV-1201(北京瑞利分析仪器公司)测其在600 nm 处的光密度(D600nm)来表示，培养液D600nm=1］，再加入1 mL 0.2 mol·L-1CaCl2溶液，摇匀，用100 g·L-1的NaOH溶液调pH 为8.0，搅拌60 s，静置5 min，取上清液，测定其在波长550 nm 下的光密度(D550nm).以空白培养液代替细菌培养液做对照［22］.

式中，A 为对照上层清液的D550nm;B 为样品上层清液的D550nm.

1．3 培养温度以及培养基中碳源、氮源和初始pH对絮凝活性的影响

培养温度对絮凝活性的影响:培养液灭菌冷却后，接入菌YH39，将各三角瓶分别置入温度设置为25、30、35、40 ℃的恒温振荡器中，3 个重复，每隔6 h测絮凝活性，共培养48 h.

碳源利用采用Biolog 测定［21］.用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、糊精、淀粉、乳糖分别代替VM 培养基中的碳源，将50 mL 培养液装入250 mL 三角瓶中，分别接种已活化24 h 的菌株YH39.在恒温振荡器中30 ℃、180 r·min-1振荡培养24 h 后测其絮凝活性.

用硝酸钠、氯化铵、硝酸钾、硫酸铵、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨分别代替VM 培养基中的氮源，将培养液50 mL 装入250 mL 三角瓶中，分别接种已活化24 h 的菌株 YH39.在恒温振荡器中30 ℃、180 r·min-1振荡培养24 h 后测其絮凝活性.

培养液初始pH 对絮凝活性的影响:三角瓶中的培养液的初始pH 用φ 为10% 的HCl 或10% 的NaOH 分别调成5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，3 个重复，灭菌冷却后，接入菌YH39.在恒温振荡器中，30 ℃培养24 h 后测絮凝活性.

1．4 发酵参数

在7.5 L 发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司)上进行发酵，发酵过程的温度设定为30 ℃，罐压为0.05 MPa，装液量为3 L，接种量为3%，发酵初期搅拌转速设置为100 r·min-1，通气量2.0 L·min-1，发酵第12 小时搅拌，转速升到125 r·min-1，通气量升到4.0 L·min-1.通过测定菌体浓度(用D600nm表示)、pH、溶氧、发酵液的絮凝活性等参数，描述该生产菌株的发酵动力学规律.

1.5 絮凝体系的pH 和金属离子对絮凝活性的影响

用φ 为10%的HCl 或10%的NaOH 将三角瓶中高岭土悬液的pH 分别调为4、5、6、7、8、9、10、11、12，然后再加入1 mL 发酵液和1 mL 0.2 mol·L-1CaCl2溶液，测其絮凝率.每个pH 梯度做3 个重复.

分别用1 mL 浓度为0.2 mol·L-1的MgCl2、NaCl、CaCl2、FeCl2、AlCl3、MnSO4溶 液，代 替0.2 mol·L-1CaCl2溶液加入到高岭土悬液中，测其絮凝率.以不加金属离子做空白对照.

1．6 絮凝活性成分分布和耐热性

将发酵液离心，分别测定发酵液、发酵上清液、菌细胞悬液的絮凝活性.从同一个三角瓶中取出发酵液，分别以60、80、100 ℃加热30 min，另一管不加热.室温冷却后，测各管中发酵液的絮凝活性，每管取样3 次做重复测定.

1．7 絮凝剂的提取和成分分析

培养液先稀释1 倍，离心收集上清液，加入3 倍体积的φ 为95% 乙醇溶液，震荡混匀;4 000 r·min-1离心20 min，收集沉淀.沉淀重新溶于水，加入0.5 倍体积的氯仿和正丁醇(体积比为5∶2)，震荡混匀、离心、收集含多糖的上相液.上相液中加入3倍体积的φ 为95%乙醇溶液，收集沉淀.按上述方法重复2 次，收集沉淀，45 ℃烘干，得絮凝剂粗提品，计算每升培养液提取絮凝剂质量.

光谱测定、molish 反应、蒽酮反应、双缩脲反应、茚三酮反应参照文献［23-24］进行.

1．8 印染废水处理

3 种废水分别来源于广州兴利洗染厂洗牛仔裤产生的废水，该废水呈蓝色;佛山市高明区汇益纺织实业有限公司染布产生的废水;佛山市高明区骏有纺织印染有限公司染布产生的废水.在处理之前先用pH 计测各种废水的pH、用紫外分光光度计测D550nm，重铬酸钾法［25］测化学耗氧量(CODCr).

分别采用微生物絮凝剂(发酵离心上相液代替)、φ 为1%的聚合碱式铝稀释液、φ 为1%的聚合碱式铝稀释液+φ 为1%的聚丙烯酰胺溶液处理100 mL 上述3 种废水.每处理100 mL 废水加入0.2 mol·L-1CaCl2溶液2 mL，YH39 发酵离心上相液1 mL，用100 g·L-1NaOH 调pH.用1 mL φ 为1%的聚合碱式铝稀释液处理100 mL 的印染废水.用聚合碱式铝和聚丙烯酰胺联合处理废水，则先加聚合碱式铝稀释液0.5mL，摇匀，再加聚丙烯酰胺稀释液0.2 mL.每次处理均在加入絮凝剂后充分搅拌60 s，再静置20 min，测废水上相液的D550nm、CODCr和pH.

2 结果与分析

2．1 产微生物絮凝剂的菌株筛选和菌落特征

从135 株菌中筛选到的具有絮凝活性的菌株YH39，高岭土悬液的絮凝试验中发现，菌株YH39 发酵液的絮凝活性最高，对高岭土悬液的絮凝率可达87.7%，其沉淀高岭土的速度最快，且沉淀后的颗粒大而稳定.

菌株YH39 为革兰阴性菌，有荚膜.菌落在VM琼脂平皿中培养24 h，生长良好，生长速度快，菌落大且凸起、边缘圆整、光滑、无色、不透明、潮湿，挑起有黏稠样物质，无特殊的味道.

将所测得的YH39 16S rDNA 序列与GenBank 数据库相关序列进行比对，结果显示与越南伯克霍尔德菌 Burkholderia vietnamiensis G4 的相似性为98.6%.

2．2 培养基中的碳源和氮源对絮凝活性的影响

菌株对不同碳源的利用情况见表1.YH39 可以利用葡萄糖、蔗糖、糊精、麦芽糖等常见糖，但不可以利用淀粉、尿素等作为碳源，YH39 不能利用甘氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、L-亮氨酸等氨基酸作为碳源生长，但能够利用苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、色氨酸、天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-羟脯氨酸等氨基酸作为碳源生长.

不同碳源对絮凝活性的影响见图1Ⅰ.由图1Ⅰ可知，加入不同的碳源培养后，培养液的絮凝活性差异较大，以葡萄糖为碳源时，培养液的絮凝率最高，蔗糖、糊精次之，而以淀粉为碳源时，发现菌株不能生长，培养液无絮凝活性，且由于淀粉不可溶，絮凝率测得为负值.所以在以后的培养中菌株YH39 采用廉价高效的葡萄糖为产絮凝剂的碳源.

不同氮源对絮凝活性的影响见图1Ⅱ.由图1Ⅱ可知，加入不同的氮源培养后，培养液的絮凝活性差异较大，以蛋白胨为碳源时，培养液的絮凝率最高，为87.6%，其次为硝酸钾，絮凝率高达87.1%，这2 种氮源效果几乎差不多，但由于硝酸钾作为氮源比蛋白胨要经济得多，在实际应用中比较可行.故在以后的试验中采用硝酸钾为YH39 产絮凝剂的氮源.

表1 菌株YH39 碳源利用情况1)Tab．1 The utilization of carbon sources by strain YH39

图1 培养液中碳源和氮源对絮凝活性的影响Fig.1 The bioflocculant effects of different carbon and nitrogen sources utilized by strain YH39

2．3 培养温度和初始pH 对絮凝活性的影响

培养温度对絮凝活性的影响见图2，在25～40 ℃各温度梯度下，培养液的最高絮凝活性差异不显著，均可达到94%左右，但温度越高，絮凝活性达到最高所需的培养时间越少，如在25 ℃时达到最高絮凝活性所需时间为48 h，而40 ℃所需时间仅为18 h，且从图2中还可得知，培养温度越高，达到最高絮凝活性后，随培养时间的延长，絮凝活性降低的速度越快.

菌株YH39 在初始pH 为5.5～7.5 的范围内均可以较好的产絮凝活性物质，尤其是在初始pH 为6～7 之间产絮凝活性物质最多，培养液的絮凝率高达94%.而当初始pH 在碱性条件下，培养液的絮凝活性显著下降，特别是在初始pH 为9 时，培养液的絮凝率仅为28.9%.

2．4 发酵过程动力学的研究

发酵过程中，溶氧量在发酵开始4 h 后急剧下降，同时此阶段发酵液pH 随之下降，在发酵第10 小时溶氧量下降到16.2 mg·L-1，pH 下降到6.19.在发酵第16 小时，pH 开始回升，溶氧量也开始回升，此后，发酵液的pH 和溶氧量一直上升.如果剔除在发酵第12 小时提高搅拌转速和通气量的影响，发酵液的溶氧与pH 几乎呈一致的变化趋势.

在发酵第18 小时之前，菌体浓度(D600nm)迅速升高，随着菌体浓度不断地增大，发酵液的絮凝活性也不断增大，在发酵第18 小时菌体浓度达到最高，发酵液的絮凝活性也达到最高，而在发酵第18～36 h，菌体浓度不断下降，发酵液的絮凝活性维持在高位不再增加(图3).

图2 不同培养温度对絮凝活性的影响Fig.2 Effects of different culture temperatures on the flocculation activity

图3 发酵过程菌体浓度和絮凝活性的动态变化Fig.3 The dynamic changes of biomass concentration and flocculating activity in the fermentation process

在整个发酵阶段，菌株YH39 的生长延迟期非常短，在发酵第4 小时菌株进入对数生长期，pH、溶氧量迅速下降，菌体浓度和发酵液的絮凝活性也迅速增加.在发酵第16 小时，pH、溶氧量开始回升，菌体浓度也几乎达到最高值.菌株生长的稳定期非常短，发酵第18—36 小时，菌株的生长进入衰亡期，菌体浓度下降很快，pH、溶氧量继续回升.在发酵过程中絮凝活性与菌体浓度呈现了一定的相关性.

2．5 絮凝体系的pH 和金属离子对絮凝活性的影响

絮凝体系的pH 对絮凝活性的影响见图4.该絮凝剂在酸性条件下的絮凝率非常低，而在碱性条件下，絮凝活性很好，絮凝率随着pH 的升高而增加，当pH 为8 时絮凝率达到96.1%，但再增加高岭土悬液的pH 对絮凝率的提高不显著.

与不加离子的空白对照相比，Na+对絮凝活性无促进作用，Fe2+对絮凝活性有抑制作用，而其他各金属离子对絮凝活性均有显著的促进作用，其中又以Ca2+的助凝效果最好，Mg2+次之，结果说明，此絮凝剂需在Ca2+等阳离子的助凝作用下才能表现好的絮凝活性.

图4 絮凝体系pH 对絮凝活性的影响Fig.4 The flocculation effects with different pH values

2．6 絮凝活性成分分布、耐热性及成分

发酵液、离心后的上清液及菌细胞悬液絮凝效果分析表明，具有絮凝活性的成分大部分存在于发酵离心后的上清液中，其絮凝率达93.0%左右，离心后菌体制成的菌细胞悬液的絮凝活性非常低，絮凝率仅为10%左右.这说明絮凝活性成分是菌体在生长过程中分泌到发酵液中的代谢产物，菌体本身几乎不起絮凝作用.对离心上清液和发酵液分别加热至60、80 和100 ℃，随着温度的升高，发酵液的絮凝活性有所降低.发酵液在100 ℃加热30 min 后，对高岭土的絮凝率仍然维持在91%，而在60 ℃加热30 min 后，絮凝活性与不加热差异不显著，说明此絮凝剂的耐热性较好.

采用高速离心、乙醇沉淀、干燥等过程后得到絮凝剂粗提品.经检测，絮凝剂粗提品的1 000 倍稀释液的絮凝率为86.2%.絮凝剂粗提品的稀释液在260 和280 nm 处未发现特征吸收峰，初步表明絮凝剂成分中无核酸类物质和蛋白质.进一步的双缩脲反应及茚三酮反应试验结果表明，絮凝剂成分中无蛋白质或氨基酸成分.Molish 反应和蒽酮反应结果表明，絮凝剂中含有糖类物质.

2．7 废水处理

用粗提取的絮凝剂处理广州市兴利洗水厂废水，废水的D550nm由0.974 下降到0.021，CODCr由418.7 mg·L-1下降到115.7 mg·L-1;用该絮凝剂处理佛山市高明区汇益废水，废水的D550nm由0.729 下降到0.083，CODCr由421.3 mg·L-1下降到165.0 mg·L-1;用粗提取的絮凝剂处理佛山市高明区骏有废水，废水的D550nm由0.948 下降到0.034，CODCr由519.6 mg·L-1下降到114.2 mg·L-1.说明用该絮凝剂处理3 种不同废水的生物絮凝效果显著(图5)，脱色率与化学絮凝剂(聚合碱式铝、聚合碱式铝+聚丙烯酰胺)相当，CODCr的去除率均比这2 种化学絮凝剂低.但试验中的3 种废水经微生物絮凝剂处理后，剩余CODCr不是很高，达到200 mg·L-1的国家二级排放标准.

图5 絮凝剂对3 种不同印染废水的处理效果Fig.5 Effects of bioflocculants on the three types of different dyeing wastewater

3 讨论与结论

目前国内外的研究者主要从污水、活性污泥或土壤中筛选和分离微生物絮凝剂产生菌，而对产絮凝剂的植物内生菌的筛选还很少报道.本研究筛选到1 株分离自药用野生稻Oryza officinalis 能产絮凝剂的固氮菌株YH39，表明微生物絮凝剂产生菌的来源非常广泛.

Shih 等［26］报道地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CCRC12826 的受试碳源中，葡萄糖、果糖、乳糖均不利于絮凝剂合成，而戊烯二酸、柠檬酸、甘油则是絮凝剂合成的有利碳源，地衣芽孢杆菌CCRC12826能利用氯化铵作为氮源合成絮凝剂，其他铵盐如硫酸铵则效果不佳，使用硝酸铵时甚至无法合成絮凝剂.彭辉等［27］认为蔗糖是TH6 产絮凝剂的良好碳源，产生的菌量相对较多，其次为葡萄糖，而以其他物质为碳源时，絮凝率较低，以硝酸钠为氮源，絮凝效果最好，产生的菌量也最多，而以硫酸铵作氮源时，虽然菌体生长较旺盛，但培养液絮凝活性很差.由此可见不同种类的微生物产絮凝剂最适的碳源、氮源相差很大.在本研究中发现YH39 产絮凝剂最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为硝酸钾.研究还发现无机盐MgSO4和FeSO4代替Döbereiner-basic 和Fe(Ⅲ)EDTA 加入基础培养液中，培养液的絮凝活性不受影响.但如果不加入这些无机盐，培养液会产酸，pH 下降明显，非常不利于絮凝剂的合成，这与游映玖［28］研究得出Mg2+、Fe2+会抑制培养基中絮凝剂的分泌的结果不同，但与黄晓武等［29］研究的结果相似.可能是不同的微生物合成絮凝剂的机制不同.

培养温度主要影响菌株YH39 的絮凝活性达到最高时所需的培养时间，而对其絮凝活性的最高值影响不显著，但培养温度高会在培养后期不利于絮凝活性的稳定.虽然从生理生化试验中发现菌株YH39 可以在pH 4～9 的环境中正常生长，但菌株YH39 在pH 为6～7 的中性条件下培养，发酵液的絮凝活性最好，过酸或过碱的环境均不利于絮凝剂的合成.菌株YH39 在装液量低和摇床转速高的条件下，培养液的絮凝活性要显著高于装液量高和摇床转速低的条件下的絮凝活性，这表明充足的氧气供给有利于此菌产微生物絮凝剂，这与大部分其他微生物絮凝剂生产菌类似.接种量在0.2%～4.0%之间，絮凝活性变化不显著，但当接种量超过8%时，絮凝活性显著下降.主要原因可能是接种量过高会带入过多种子液里的代谢废物到发酵液中，从而影响絮凝活性.

该絮凝剂在pH 8 以上的碱性环境中能表现出较高的絮凝活性，不适宜处理酸性较强的废水，絮凝剂的絮凝能力受pH 影响的原因是酸碱度的变化会改变生物聚合物的带电状态和中和电荷的能力以及被絮凝物质的颗粒带电情况［30］.目前从国内外对微生物絮凝剂的提取和成分鉴定结果来看，大部分微生物絮凝剂属于多糖类物质，泰国的Dermlim 等［31］分离到克雷伯氏菌Klebsiella sp.S11，其所产絮凝剂通过红外光谱分析及各种化学分析，确定是一种酸性多糖.本研究获得絮凝剂的粗提品，初步确定其成分为多糖类物质.

印染废水成分复杂、色度大、浓度高且生物难降解物质多，是较难处理的工业废水之一.本研究的絮凝剂对3 种印染废水的脱色率与传统的化学絮凝剂差不多，但生物絮凝剂不会造成二次污染.虽然生物絮凝剂对废水CODCr的去除率比传统絮凝剂低，但应用此絮凝剂处理这3 种废水后，其CODCr、pH 能够达到国家二级排放标准，显示了此絮凝剂的应用前景.

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