三氮脒在猪血浆的药物-蛋白结合研究

李 博，赵吉祥，陈杖榴，路文华，韩可可，徐 维，陈 红

(华南农业大学 兽医学院/国家兽药残留基准实验室，广东 广州510642)

三氮脒是用于家畜的抗血液原虫药，主要治疗锥虫病、巴贝斯梨形虫病、泰勒梨形虫病和马媾疫锥虫病等.我国属锥虫病疫区［1-3］，家畜锥虫病较为常见，三氮脒在临床治疗中有重要的应用价值.锥虫的宿主特异性不严格［4］.近几十年随着世界范围内养猪业的发展，有关猪感染、发生锥虫病的报道逐渐增多［5-13］，使用三氮脒治疗猪锥虫病的报道也有增加.但是国内有关三氮脒的药理学和毒理学研究较少.从已有的报道来看，本药的药动学特征在不同动物种属间有较大差异，安全范围小，耐受剂量在种属间和个体间差异大，临床常见中毒反应，一般为副交感神经兴奋样症状［14］.因此，以猪为靶动物开展药理学和毒理学研究，是兽医临床安全有效用药、有利于消费者的健康安全的重要基础研究.在牛、羊、犬的研究显示，三氮脒的血浆蛋白结合率较高［14-16］.药物与机体蛋白质结合，形成可逆的药物-蛋白复合物，对药物的跨膜转运、发挥治疗作用或是引起不良反应和体内代谢过程都有重要影响.药物的血浆蛋白结合情况与动物种属间遗传上的差异有关.研究药物在特定动物的蛋白结合情况可以解释一些药动学特征(如排泄缓慢);也可以预测当非蛋白结合型(游离)药物浓度增加时(由机体蛋白质代谢异常、竞争性结合的存在或者用药量过高导致的)，可能出现较强的治疗作用或中毒反应骤增的现象.

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

高效液相色谱仪:美国Dionex 公司，Ultimate 3000 系列，配备自动进样器，四元泵，在线脱气泵，柱温箱，色谱工作站软件.色谱分析柱:Hypersil BDS C18，5 μm，250 mm×4.6 mm，美国Thermo 公司.离心机:Mach 1.6 R 冷冻型，美国Thermo 公司.超滤管:Millipor，UFC501024，0.5 mL.

三氮脒标准品为Sigma 公司产品，质量分数为90%(以C14H15N7·2C4H7NO3计).乙腈、甲醇为色谱纯，Mallinckrodt Bater 公司产品.冰乙酸、三乙胺、辛烷磺酸钠均为国产分析纯试剂.三氮脒粉针剂:批号12083，三氮脒质量分数为100%(采用HPLC 法，与三氮脒标准品比较，测得实际质量分数为96%)，兰州正丰制药有限责任公司产品.

1．2 溶液配制

三氮脒标准储备液:准确称取三氮脒标准品(C14H15N7·2C4H7NO3)101.9 mg 于50 mL 棕色容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度，摇匀即得1 000 μg/mL 的三氮脒标准储备液(以C14H15N7计)，密封，于4 ℃冰箱保存备用，有效期1 个月，临用前以超纯水稀释成系列标准工作溶液.0.005 mol/L 辛烷磺酸钠溶液:称取1.08 g 的辛烷磺酸钠，于1 000 mL容量瓶内用超纯水溶解定容;此溶液转移至1 L 试剂瓶中，添加1 mL 三乙胺，用冰乙酸调节pH 至3.2，经0.45 μm 微孔滤膜过滤后备用.三氮脒注射液:取适量三氮脒粉针剂，用灭菌生理盐水配成70 mg/mL 的注射液，临用现配.

1．3 血浆中游离药物分离方法

取0.5 mL 血浆样品，加人到Millipor 超滤管中，在37 ℃以2 700 r/min 离心20 min，取50 μL 超滤液用高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)分析药物含量.

1．4 药物含量的HPLC-UV 分析法

紫外检测波长372 nm.流动相V(乙腈)∶V(pH 3.2 的0.005 mol/L 辛烷磺酸钠溶液)=30∶70;流速1.000 mL/min.柱温:24.0 ℃，进样量50 μL.外标法标准曲线定量.

游离三氮脒血药浓度标准曲线制备:取适量pH7.4 磷酸盐缓冲溶液，稀释不同质量浓度的三氮脒系列工作溶液，使三氮脒的质量浓度分别为0.01、0.02、0.05，0.10、0.20 、0.50、1.00、2.00 μg/mL.按前述HPLC-UV 条件分析.以药物响应信号的峰面积为x，以相应药物质量浓度为y 作直线回归，求得标准曲线方程和相关系数.

1．5 血浆药物总浓度(蛋白结合型药物与游离型药物之和)的测定

参考赵吉祥［17］建立的猪血浆样品三氮脒浓度测定的高效液相色谱法，用乙二胺四乙酸二钠溶液稀释猪血浆样品，用SEP-PAK-C18固相萃取小柱富集全部药物(包括蛋白结合型药物和游离型药物)，再以含有离子对试剂的乙腈洗脱.以氮气吹干洗脱液，流动相复溶后取50 μL 按“1.4”HPLC-UV 法测定药物含量.外标法标准曲线定量.

三氮脒血药浓度标准曲线制备:取适量空白猪血浆样本，添加不同质量浓度的三氮脒系列工作溶液适量，按前述方法处理后，按“1.4 ”HPLC-UV 法测定药物含量.以药物响应信号的峰面积为x，以相应药物质量浓度为y 作直线回归，求得标准曲线方程和相关系数.猪血浆中三氮脒质量浓度在0.01～40.0 μg/mL 范围内可准确定量;血浆中三氮脒质量浓度为0.05、0.50、10.00 μg/mL 时，相对回收率≥89.09%，变异系数在0.41%～0.81%之间.猪血浆中三氮脒的定量限为5 ng/mL，检测限为2 ng/mL.

1．6 体外测定猪血浆三氮脒－蛋白结合率的方法

空白猪全血样本采自临床健康、未使用任何药物和饲料添加剂的大三元杂交猪，经抗凝和离心后，即为空白猪血浆样品.

参照宋粉云［18］的方法，取适量的三氮脒标准工作液加入空白猪血浆中，混匀，制得药物质量浓度为0.05、0.50、10.00 μg/mL 的3 个不同质量浓度血浆样品，每个质量浓度样品各5 份.样品在37 ℃避光孵育1 h 后，取0.5 mL，加人Millipor 超滤管中，在37℃以2 700 r/min 离心20 min，取超滤液50 μL 按“1.4”HPLC-UV 法分析药物含量.

按照公式(1)计算药物的血浆蛋白结合率:

1．7 动物给药试验

6 头健康的杜洛克×长白×约克夏杂交猪，公母各半，约10 周龄，体质量(23.5 ±2.2 )kg，购自广东省良种猪场.常规饲养，自由饮水和采食.试验前观察2 周，临床健康.随机分成2 组，按体质量分别以7和14 mg/kg 肌内注射三氮脒注射液.给药后，分别在3、5、15、60 min 经前腔静脉采血.按随机交叉进行不同剂量给药，时间间隔为10 d.

全血样品经肝素抗凝、离心分离血浆.血浆样品分别按“1.3”、“1.4”和“1.5”处理并测定游离药物质量浓度和血浆药物总质量浓度，按照公式(1)计算三氮脒-血浆蛋白结合率.不同给药剂量间的药物-血浆蛋白结合率数据采用统计学软件SPSS 分析.

2 结果与分析

2．1 样品处理和HPLC-UV 方法的特异性

试验获得的色谱图见图1～图4.对比图1～图3可见，在“1.4”的色谱条件下，三氮脒的保留时间是5.2 min，在目标药物峰附近无杂质干扰，血浆样本的内源性杂质与三氮脒信号分离良好.

图1 空白血浆超滤液的色谱图Fig.1 Chromatogram of the blank swine plasma pretreated by ultrafiltration

图2 0.50 μg/mL 三氮脒标准溶液的色谱图Fig.2 Chromatogram of diminazene standard solution 0.50 μg/mL

图3 空白血浆添加三氮脒至0.50 μg/mL 的超滤液色谱图Fig.3 Chromatogram of the blank swine plasma spiked with diminazene at 0.50 μg/mL，pretreated by ultrafiltration

图4 以7 mg/kg 剂量给药60 min 后猪血浆样品超滤液色谱图Fig.4 Chromatogram of swine plasma sample after administration at 7 mg/kg，60 min，pretreated by ultrafiltration

2．2 猪血浆三氮脒－蛋白结合率

体外测定三氮脒-血浆蛋白结合率为74.68%～95.90%，详见表1.

动物给药试验获得的猪体内药物-血浆蛋白结合率见表2.猪以7 和14 mg/kg 剂量肌内注射三氮脒，体内的药物蛋白结合率分别为84.11%～89.69%和82.96%～88.65%.

药物的蛋白结合率在体内、体外试验中都很高.但高剂量组(14 mg/kg)，注射后5 min(接近达峰时间tmax)血浆样品的蛋白结合率却显著低于相同时间点低剂量组样品，差异极显著(P＜0.01).

表1 体外测定的三氮脒－血浆蛋白结合率1)Tab．1 Diminazene-protein binding rate tested in vitro

表2 猪以7 和14 mg/kg 剂量给药后三氮脒－血浆蛋白结合率1)Tab．2 Diminazene-protein binding rate at two dosages(7，14 mg/kg)tested in vivo %

3 讨论与结论

3．1 血浆中结合型药物和游离药物的分离方法

宋粉云等［18］认为，采用超滤法时，离心时间应尽量短，温度也对结果产生影响，超滤过程一般应选择接近恒温动物体温的37 ℃.本试验结合超滤管的使用说明，对离心时间、转速(离心力)等进行了比较，最后选择了37 ℃以2 700 r/min 离心20 min 的超滤方法.

3．2 动物给药试验的剂量选择

目前，我国2010 版《兽药使用指南》仅规定了牛、羊、马等动物的剂量和给药方案.国外有人对临床感染发病猪采用不同剂量治疗的疗效作了比较.如Jibike 等［19］用剂量7 mg/kg 的三氮脒治疗猪锥虫病，给药后17 d 猪锥虫病复发.Waiswa［7］分别用7 和14 mg/kg 2 个剂量的三氮脒来治疗临床猪锥虫病病例，发现经7 mg/kg 剂量治疗的病猪在病情好转后有复发现象，而以14 mg/kg 治疗的病猪完全治愈.本研究结合国内外报道的临床治疗用量，将试验剂量确定为7 和14 mg/kg 2 个剂量水平进行观察比较.

3．3 三氮脒在家畜血浆中与血浆蛋白的结合率

Aliu 等［15］报道了羊静脉注射2 mg/kg 三氮脒后，药物与羊血浆蛋白结合率为65%～85%.Miller等［16］研究三氮脒在犬体内的药动学过程中发现，给犬肌内注射4.2 mg/kg 三氮脒1 h 后，三氮脒与血浆蛋白的结合率为75%.血浆蛋白结合率高的药物通常消除缓慢，体内的平均滞留时间较长，这与报道［14］中的半衰期较长相符.

本试验发现，三氮脒在体内和体外与猪血浆蛋白的结合率也很高.以较高剂量(14 mg/kg)给药后，采自5 min(接近达峰时间tmax)的血浆样品蛋白结合率为82.96%，比低剂量组相同时间点的蛋白结合率低，差异极显著(P＜0.01).据此推测，三氮脒与蛋白质的结合可能存在饱和现象.虽然猪体内各类药物结合蛋白的研究报道较少，难以进一步求得结合常数等精确数据，但已可以预测，饱和后体液内游离的药物分数增加，将提高抗虫效果，同时也会使不良反应的程度加剧.从根本意义上看，为保障疗效和安全性，设置剂量时应考虑到其他竞争结合物的存在，以及锥虫感染可能会导致的体内蛋白质变化.

［1］陈启军.中国锥虫病的研究概况［J］.吉林畜牧兽医，1991(3):4-7.

［2］凌英济.家畜伊氏锥虫病流行病学调查［J］.中国兽医科技，1996，9(6):17-19.

［3］王光雷，努素甫艾力.中国家畜伊氏锥虫病研究进展［J］.草食家畜，1995，2(87):52-57.

［4］伦照荣，张光朴.二氟甲基鸟氨酸与贝尼尔配用治疗实验伊氏锥虫病［J］.中山大学学报:自然科学版，1990，29(4):145-149.

［5］NG'AYO M O，NJIRU Z K，KENYA1E U，et al，Detection of trypanosomes in small ruminants and pigs in western Kenya:Important reservoirs in the epidemiology of sleeping sickness［J/OL］.Kinetoplastid Biol Dis，2005，4:5(2005-07-14)［2013-05-30］.http:∥www.kinetoplastids.com/content/4/1/5.

［6］JAMONNEAU V，RAVEL S，KOFFI M，et al.Mixed infections of trypanosomes in tsetse and pigs and their epidemiological significance in a sleeping sickness focus of Côte d’Ivoire［J］.Parasitology，2004，129(Pt6):693-702.

［7］WAISWA C.Porcine trypanosomiasis in southeastern Uganda:Prevalence and assessment of therapeutic effectiveness［J］.Bulg J Vet Med，2005，8(1)，59-68.

［8］SIMUKOKO H.，MARCOTTY T，PHIRI I，et al.The comparative role of cattle，goats and pigs in the epidemiology of livestock trypanosomiasis on the plateau of eastern Zambia［J］.Vet Parasitol，2007，147(3/4):231-238.

［9］陈仁桃，陈仁豪，陈仁余，等.猪伊氏锥虫病的诊治报告［J］.养猪，1997(1):40.

［10］刘九生.猪伊氏锥虫病的诊治［J］.四川畜牧兽医，2000，1(27):45.

［11］王永婵，孙书芳，陈保国，等.猪锥虫病的诊断［J］.河南畜牧兽医，2002，23(2):31-32.

［12］杨玉芬，李维召，闫信权，等.猪伊氏锥虫病的诊治［J］.云南畜牧兽医，2003(4):40.

［13］王天奇，董发明，龙塔，等.育肥猪伊氏锥虫病的诊断和控制［J］.湖北畜牧兽医，2004(2):44-45.

［14］MILLER D B，SWAN G E，LOBETTI R G，et al.The pharmacokinetics of diminazene aceturate after intramuscular and intravenous administration in the healthy dog［D］.Pretoria:University of Pretoria，2005.

［15］ALIU Y O，ODEGAARD S，SOGNEN E.Diminazene/berenil:Bioavailability and disposition in dairy goats［J］.Acta Vet Scand，1984，25(4):593-596.

［16］MILLER D M，SWAN G E，LOBETTI R G，et al.The pharmacokinetics of diminazene aceturate after intramuscular administration in healthy dogs［J］.J S Afr Vet Assoc，2005，76(3):146-150.

［17］赵吉祥.三氮脒在健康猪的药动学研究［D］.广州:华南农业大学，2013.

［18］宋粉云.药物分析实验［M］.北京:中国医药科技出版社，2007:160-161.

［19］JIBIKE G I，ANIKA S M，Treatment of experimental trypanosomiasis in pigs［J］.Br Vet J，1991，147(6):556-564.