参 麦 注 射 液 对 早 产 脑 损 伤 仔 鼠 脑 组 织 GAP-43 和IL-21 表达的影响

王冬 周慧茹

参 麦 注 射 液 对 早 产 脑 损 伤 仔 鼠 脑 组 织 GAP-43 和IL-21 表达的影响

王冬 周慧茹

目的 从宫内感染致早产的仔鼠脑组织中神经生长相关蛋白 (GAP-43)和白介素 21(IL-21)的表达方面研究参麦的脑损伤保护机制。方法 采用孕鼠腹腔注射脂多糖造成宫内感染模型 , 将早产仔鼠随机分为 ：模型组、神经节苷脂组、参麦组、联合组 , 腹腔注射生理盐水组所生仔鼠为对照组 , 每组保证成活 8 只。7 日龄时开始分组用药 ：模型组予生理盐水腹腔注射 , 神经节苷脂组予申捷腹腔注射 , 参麦组予参麦注射液腹腔注射 , 联合组予申捷联合参麦注射液腹腔注射 , 共 14 d。21 日龄时取仔鼠脑组织 ,应用免疫组化方法对 GAP-43 和白介素 21 进行测定。结果 用药组仔鼠脑组织中 GAP-43 表达增多、白介素 21 表达减少 , 其中联合组疗效优于神经节苷脂组和参麦组 , 差异有统计学意义 (P＜0.05)。结论 参麦注射液对宫内感染致早产脑损伤仔鼠的脑保护作用可能与其促进脑组织中 GAP-43 表达增多、抑制白介素 21表达有关。

参麦 ；宫内感染 ；脑白质损伤 ；神经生长相关蛋白 ；白介素 21

脑瘫是现代儿童致残主要原因之一 , 随着医疗技术的提高 , 早产成为脑瘫最主要的致病因素。早产是围产期诸多不良因素作用的结果 , 宫内感染导致的早产主要是由于感染引起的炎症反应所致 , 诸多细胞因子参与其中 , 形成宫内感染 -细胞因子的释放-脑白质损伤-脑瘫链条。寻求有效预防或改善宫内感染所致的脑损伤的药物、降低脑瘫的发生率是基础医学和临床医学的重要研究课题。参麦注射液可改善心、肝、脑等主要脏器的供血［1］, 目前临床上多用于缺血性心、脑血管疾病的治疗。本研究旨在研究参麦注射液对宫内感染致早产幼鼠脑组织神经生长相关蛋白 (GAP-43)、白介素 21表达的影响 , 为参麦注射液治疗早产儿脑损伤寻求实验室证据。

1 材料与方法

1. 1 材料 清洁级成熟 Wistar大鼠由郑州大学动物实验中心提供。雌性大鼠 30只 , 平均体重 (250±20)g, 雄性大鼠 15只 , 平均体重 (280±20)g。常规饲养 , 饮食自由 , 12 h/12 h明暗周期 , 室温恒定 21℃。1周后 , 16：00以 2:1合笼 , 次日 7:00行阴道脱落细胞涂片检查 , 查得精子的孕鼠另笼饲养 , 检查当日为孕第0天。

1. 2 主要试剂 脂多糖 (LPS)血清型、GAP-43试剂盒、白介素 21 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。参麦注射液 ：河北神威药业有限公司生产 。申捷 ：神经节苷脂钠注射液 , 吉林英联生物制药股份有限公司生产。

1. 3 模型制备及分组 将受孕大鼠随机分为生理盐水组(n=8只 )和 LPS组 (n=16只 ), LPS组 孕 鼠 于 孕 16 d腹 腔 注射 LPS 450 μg/(kg·d), 连续 2 d, 生理盐水组腹腔注射同等剂量的生理盐水 , 连续 2 d。孕 22 d前分娩的仔鼠为早产仔鼠。分娩后随机选取两组孕鼠各 2只 , 取胎盘行 HE染色观察宫内感染情况。随机选取生理盐水组足月产仔鼠8只作为对照组 , 选取 LPS组早产仔鼠 32只 , 随机分为参麦组、神经节苷脂组、联合组、模型组等四组 , 每组 8只仔鼠。五组大鼠恒温恒湿 , 母乳喂养 , 7日龄时开始腹腔注射用药 ：参麦组予参麦注射液 8 ml/(kg·d), 神经节苷脂组予申捷 4 ml/(kg·d),联合组予申捷联合参麦注射液 (参麦注射液 8 ml/(kg·d)申捷 4 ml/(kg·d)；模型组予生理盐水 4 ml/(kg·d), 共 14 d。21日龄时各组仔鼠均断头处死 , 取脑组织固定后石蜡包埋 , 4 μm切片厚度 , 应用免疫组化方法对 GAP-43和 IL-21进行测定。

1. 4 统计学方法 使用统计学软件 SPSS13.0处理数据 , 计量资料以均数 ± 标准差 ( x-±s)表示 , 采用 t检验 , 采用单因素方差分析比较不同组间的相关性 , 以 P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 胎盘病理检查结果 生理盐水组母鼠胎盘病理检测未见明显炎症反应 , LPS组母鼠胎盘内可见大量中性粒细胞浸润、血管充血、水肿。

2. 2 免疫组化的检测结果 GAP-43、IL-21的检测按免疫组织化学试剂盒步骤进行 , 利用自动图像分析系统对染色结果进行定量分析。各组各取 6张组织切片 , 镜下随机选取 6个位点测量阳性免疫反应产物面积 , 取平均值 , 结果表1。

表1 不同组间的 GAP-43和 IL-21表达

本研究结果显示 , IL-21 在模型组脑室旁白质中含量最高 , 对照组含量最低 , 两组间相比有极显著差异 (P＜0.01)；与模型组相比 ：参麦组、神经节苷脂组 IL-21 含量明显下降 ,差异有统计学意义 (P＜0.05), 联合组 IL-21 含量明显下降 , 差异有统计学意义 (P＜0.01)；与联合组相比 , 参麦组和神经节苷脂组的 IL-21 含量偏高 (P＜0.05)；参麦组与神经节苷脂组比较两组间差异无统计学意义 (P＞0.05)。GAP-43 在对照组脑室旁白质中阳性细胞数目属最高 , 与对照组相比 , 模型组中 GAP-43 阳性细胞数明显偏低 (P＜0.01), 联合组差异无统计学意义 (P＜0.05), 参麦组和神经节苷脂组较空白组偏低 , 差异有统计学意义 (P＜0.05)；与模型组相比 , 联合组中 GAP-43阳性细胞数明显增多 , 差异有统计学意义 (P＜0.01), 参麦组和神经节苷脂组较模型组 GAP-43 阳性细胞数增多 , 差异有统计学意义 (P＜0.05)；与联合组相比 , 参麦组和神经节苷脂组GAP-43 阳性细胞数偏低 , 差异有统计学意义 (P＜0.05)；参麦组和神经节苷脂组间相比差异无统计学意义 (P＞0.05)。

3 讨论

近年来 , 由于产科技术、围产医学、新生儿医学的发展 ,新生儿死亡率、死胎发生率均有明显下降 , 但脑瘫发病率并无减少趋势 , 重症脑瘫的比例有增多趋势 , 且早产成为脑瘫的主要病因之一。寻找可以促进损伤的脑神经反应性再生、结构重建的药物 , 从而降低脑瘫的发生率、减轻脑瘫儿的残障程度 , 是基础研究的方向。

参麦注射液源于古医方生脉散 , 由人参、麦冬等制备 ,可改善心、肝、脑等主要脏器的供血 , 能提高机体耐缺氧能力、改善微循环 ,对缺血性损害有保护性作用 , 目前临床上多用于缺血性心、脑血管疾病的治疗。但针对参麦治疗早产儿脑损伤的作用机制研究较少。神经节苷脂针具有保护脑细胞膜 ,在脑细胞的生长、分化和再生过程中起关键作用 , 同时能促进脑细胞的损伤和修复 , 维持神经功能。既往［2］研究发现外源性的神经节苷脂能明显缩短缺氧缺血性脑病的病程 , 降低缺氧缺血性脑病患儿的神经系统后遗症发生率。

LPS 是革兰阴性细菌感染后炎症反应的主要成分 , 将其注入孕鼠腹腔 , 可造成新生仔鼠早产、仔鼠脑损伤模型。有研究表明［3］仔鼠脑组织内 IL-1β、肿瘤坏死因子 (TNF-a) mRNA 呈剂量依赖性增加 , IL-1β、肿瘤坏死因子 (TNF-a)通过一氧化氮合成酶出现协同炎症反应而致脑损伤 , 而且内毒素的释放增加脑缺血及出血的危险性。

GAP-43 主要分布在已定性并开始轴突生长的神经元细胞中 , 它与轴突延伸生长、突触的形成有严格的同步性 , 因而将 GAP-43 视为研究神经生长发育和损伤修复的重要标记物之一［4］。神经节苷脂是神经细胞膜的组成成分 , 是临床应用广泛、作用明确的营养神经药物 , 对脑神经的修复有作用。本研究结果表明 , 脑损伤早期积极应用神经营养药物可使 GAP-43 表达增高 , 联合组的 GAP-43 的表达明显高于参麦组和神经节苷脂组 , 差异有统计学意义 , 说明参麦可以增强神经节苷脂的脑保护作用 , 促进神经的修复和再生。

IL-21 是一种新近发现的细胞因子 , 它可以调节 T 细胞的增值 , 促进 B 细胞、NK 细胞的增殖、分化并能提高 NK细胞杀伤活性 , 它在免疫应答中的依赖性可能根据免疫环境的变化而不同。以往研究表明［5］在免疫系统疾病 (克罗恩病、系统性红斑狼疮、艾滋病、原发性干燥综合症 )中 IL-21 对组织细胞有破坏性作用 , 同时它对肿瘤细胞有明显的抑制作用。本研究结果表明 , IL-21 在脑损伤早期表达增多 , 可能参与炎症反应的级联放大作用 , 应用营养神经药物可降低其表达 , 联合用药较单一用药效果明显 , 说明参麦注射液能够通过降低 IL-21 的表达起到其脑保护作用。

本研究结果显示 , 参麦对宫内感染致早产脑损伤仔鼠脑组织中 GAP-43 和 IL-21 表达有调节作用 , 它与神经节苷脂联合应用可明显降低脑组织中 IL-21 表达和使 GAP-43 表达升高 , 从而达到减轻脑损伤、促进神经生长、修复的作用。

综上所述 , 脑瘫的治疗疗程较长 , 无论是从经济上还是从心理上都给患者家庭带来沉重负担 , 参麦注射液是一种中药制剂 , 能够从根本上提高机体耐缺氧能力、改善微循环 ,对缺血性损害有保护性作用 , 是脑瘫患者的有效治疗药物 ,还可以大大降低脑瘫治疗的成本 , 具有很好的社会效益、可观的经济效益和特殊的学术价值。

参考文献

［1］杨明 , 孙群 , 郑志育 , 等 . 大剂量参麦注射液辅助治疗新生儿充血性心力衰竭疗效观察 .中国现代医学杂志 , 2006, 16(4): 610-611.

［2］曾林 . 神经节苷脂治疗新生儿缺氧缺血性脑病疗效观察 .中国实用神经疾病杂志 , 2009, 12(3):84-85.

［3］Saliba E, Henrot A. Inflammatory mediators and neonatal brain damage. Biol Neonate, 2001, 79(324):224-227.

［4］Shen Y, Mani S, Donovan SL, et al. Grow associated pro-tein-43 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. J Neurosci, 2002, 22(21):239-241.

［5］王士杰 . 白细胞介素 21 的基础与临床研究进展 . 安徽医药 , 2009, 13(9):1016-1017.

2014-04-11］

471000 洛阳市妇女儿童医疗保健中心康复科 (王冬 )；河南中医学院 (周慧茹 )