SN50对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用△

吴勇 叶芬 葛轶睿 陆燕 魏锐利

视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemical reperfusion injury,RIRI)在眼科临床上非常多见，是许多疾病都要经历的生理及病理过程，一些眼科常见病如视网膜中央动静脉阻塞、急性闭角型青光眼、糖尿病以及玻璃体视网膜病变等都会导致严重的视网膜缺血[1]，RIRI后视网膜结构和功能发生变化，但不是视网膜视功能得以恢复，而是出现更加严重的损害[2]，如何减轻RIRI导致的视网膜功能损害是临床急需解决的问题。本研究通过建立大鼠RIRI模型，观察分析核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活性抑制剂SN50对视网膜功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物成年SD雄性大鼠27只，体质量(220±20)g，饲养在标准的普通级环境中，所有动物经一般体格检查和眼部检查均无明显异常，随机分为正常对照组9只、RIRI组9只、RIRI+ SN50组9只。

1.2主要仪器设备及用品大鼠脑立体定位仪(Biomy公司)，ECLIPSE 80i正置显微镜(Nikon公司)，Rotor-Gene 6000荧光实时定量PCR仪(QIAGEN公司)，石蜡切片机(Leica公司)，手术器械、眼科手术显微镜(上海金钟公司)，NF-κB p50抗体(Senta Cruz公司)，GAPDH抗体(Senta Cruz公司)，SN50(Biomy公司)，TNF-α Rat ELISA Kit(Invitrogen公司)，苏木素伊红(HE)染色试剂盒(碧云天公司)。

1.3大鼠RIRI模型的建立首先用戊巴比妥钠注射液按35 mg·kg-1剂量予以大鼠腹腔注射麻醉，用立体仪固定动物，眼睑拉钩将下睑向下拉，慢慢地将眼球暴露出来，将注满乳酸林格液的4.5号头皮针从颞侧角膜缘刺入，直至前房进行灌注，不要碰到虹膜及晶状体；血压计气囊的输出管接有三通管，分别是血压计、水银压力表、输液器，输液器注满林格液，将大鼠眼压调整并维持血压计压力刻度在15 kPa，此时可以看到球结膜及虹膜的颜色变苍白，眼底视网膜的颜色也变苍白，保持前房灌注加压，使得视网膜持续缺血60 min，之后逐渐将灌注压降至正常，穿刺针头拔出。可以看到球结膜、虹膜的颜色恢复成原来的颜色，眼底视网膜的颜色也恢复至正常的橘红色，这表明所有受阻的血流已重新再通，形成了再灌注。正常对照组大鼠除不升高眼压外，其余操作步骤同RIRI组，RIRI+ SN50组的大鼠在RIRI的基础上眼部玻璃体注射1 μL SN50(50 μmol·L-1)。

1.4标本取材及HE染色RIRI后6 h、24 h、72 h采用戊巴比妥分别处死大鼠3只，摘除眼球，保留 1～2 mm视神经，标本视神经处缝线做标记。设置温度为4 ℃，并在40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h。按照不同的酒精浓度进行脱水，二甲苯透明，切片石蜡包埋，厚度4 mm，放置在干净的玻片上，再放在60 ℃烤箱后续使用。按照脱蜡、水化、苏木精液染色、体积分数1%盐酸乙醇分化、水洗、体积分数0.5%伊红液染色、水洗、脱水、透明、中性树胶封固、拍照等步骤进行操作。

1.5免疫组织化学检测NF-κB的表达部位组织切片脱蜡以及水化，在不同浓度的酒精中放置以消除内源性过氧化物酶，PBS洗2次，每次5 min；抗原的修复采用0.01 mol·L-1枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)放入微波炉加热至沸腾，再把福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片置入，每隔5 min 1次，共2次；最后进行免疫组织化学染色，清洗、加入抗原及试剂、脱洗、DAB显色、封片、备用镜检。

1.6实时定量PCR检测TNF-α的表达根据文献提供合成引物的序列：TNF-α，上游：5’-CATCCGTTCTCTACCCAGCC-3’，下游：5’-AATTCTGAGCCCGGAGTTGG-3’；Actin，上游：5’- CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3’，下游：5’- ATACCCACCATCACACCCTG-3’。提取总RNA：液氮冷却条件下研磨组织，经过试剂添加、离心、去清、静置等步骤，最后用紫外分光光度计检测各样品的OD260/OD280值来计算RNA浓度，再用10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳来确定mRNA的完整性。逆转录PCR：在42 ℃条件下逆转录反应1 h。在75 ℃条件下灭活AMV 10 min。实时定量PCR：根据相应的反应体系及反应程序，并以Actin作为内参照，计算产物的相对量。应用相对定量2-△△Ct法公式来计算结果。

1.7统计学分析使用SPSS 18.0软件对结果进行统计学分析，成组的多个样本均数采用one way ANOVA方差分析进行比较，两样本间均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠视网膜病理变化正常对照组视网膜全层结构显示清晰，未见明显异常。RIRI组在RIRI 6 h后，视网膜整个结构轻度水肿，少量细胞变性；RIRI 24 h后，视网膜各层呈现高度水肿，细胞排列紊乱，内丛状层、神经纤维层尤为明显，大部分神经节细胞出现变性；RIRI 72 h后，整个视网膜损伤更加明显，除了全层明显水肿外，各层细胞排列紊乱、结构破坏，并伴有炎性细胞的聚集。RIRI+ SN50组SN50注射6 h及24 h后可以观察到视网膜全层结构基本清晰，轻度水肿，未见明显的细胞变性；72 h后视网膜水肿有所加重，细胞排列紊乱，少量细胞变性(图1)。

2.2大鼠视网膜NF-κB的表达RIRI组在RIRI 6 h后神经节细胞层阳性表达NF-κB，24 h后NF-κB的阳性表达在神经节细胞层及内丛状层细胞尤为明显，72 h之后视网膜近全层都可以看到NF-κB的阳性表达。RIRI+ SN50组SN50注射6 h后NF-κB的阳性表达不明显，24 h后NF-κB在神经节细胞层有所表达，72 h后NF-κB阳性表达有所增强(图2)。

2.3大鼠视网膜TNF-α的表达RIRI组及RIRI+ SN50组RIRI 6 h后TNF-α的表达明显上升，与对照组相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；RIRI组与RIRI+SN50组比较，24 h后视网膜的TNF-α表达差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。

3 讨论

视网膜的血供主要包括视网膜血管以及睫状血管，但除了该两套血管系统对视网膜血供进行调控外，灌注压、血压以及眼压也能够对视网膜的血供进行调控[3]，通常在眼压发生变化或是上升时，也就是当眼压与视网膜血管的血压相等时，如果维持一段时间，视网膜的各层组织就会出现缺血或是缺氧的表现，而当血液再次流通后，视网膜的视功能伤害更加明显甚至加重，在这种情况下视网膜就会发生RIRI[4]。本研究所采用的是前房灌注加压法制作RIRI大鼠模型，通过不同的时间段来观察大鼠RIRI导致视细胞损害的严重情况。

Figure 1 Pathological changes in retina after SN50 treatment SN50处理后视网膜的病理变化

Figure 2 Expression of NF-κB in retina NF-κB在视网膜的表达情况

本研究发现，视网膜缺血后再次灌注的过程中，视网膜的病理损害随着缺血时间的延长而日趋严重。临床上闭角型青光眼患者急性发作后视网膜的视功能会明显受损，也与本次实验结果基本一致，所以说针对青光眼的高眼压要及时进行降压处理，这样对于减轻视网膜的损伤会有所帮助。临床上发生其他缺血再灌注损伤如视网膜中央静脉阻塞时，也要求尽快改善视网膜的缺血状态，尽量在最短的时间内恢复血液的通畅，在出现缺血再灌注损伤之前控制病情，因此视网膜的损伤与缺血再灌注损伤有着十分密切的关系。NF-κB是具有多种作用的转录因子，一般情况下它是以非活性的状态存在于细胞浆中，参与许多基因的表达与调控，与炎症反应、免疫应答、细胞转归等一些病理生理过程有着十分密切的关系[5]；TNF-α也是具有多种生物学功能的细胞因子，能参与机体的免疫应答、炎症反应，有实验观察到TNF-α在脑组织缺血再灌注后表达迅速增加[6]。本研究观察到在缺血再灌注条件下视网膜的NF-κB表达上调，TNF-α表达上调，大鼠视网膜的组织细胞病理性改变明显加重，说明NF-κB及TNF-α参与了RIRI。TNF-α可由NF-κB激活，同时TNF-α又能激活NF-κB形成协同作用[7]，产生细胞因子的级联效应[8]，扩大损伤及反应的程度。

Figure 3 Expression of TNF-α in rat retina after SN50 treatment(*P<0.05，**P<0.01) SN50处理后大鼠视网膜TNF-α的表达情况(*P<0.05、**P<0.01)

目前针对RIRI治疗的方法和药物比较多[9-11]，包括抗氧化剂、兴奋性氨基酸拮抗剂、钙离子阻滞剂、神经营养因子、凋亡抑制剂、糖皮质激素及中药等，但这些药物均存在给药途径和药物到达靶点发挥作用等问题需要解决。SN50 是一种NF-κB活性抑制肽，具有很强的细胞膜穿透能力[12]，能特异性地阻止NF-κB从细胞浆转移至细胞核内，从而抑制了NF-κB的DNA结合活性。本研究使用SN50干预RIRI模型大鼠，可以从形态上观察到视网膜的损伤得到很好地控制，未见明显的细胞变性及坏死。在基因调控方面，观察到24 h后视网膜的TNF-α表达与未给药相比已有统计学差异(P<0.05)。SN50可以高效地阻断NF-κB介导的细胞信号转导通路[13]，切断TNF-α-NF-κB—TNF-α的恶性循环，抑制视网膜组织细胞凋亡或死亡。SN50 作为特异性抑制NF-κB 核位移的多肽，作用相当强大，因此具有很好的应用前景。

RIRI发生在眼科临床的多种疾病中，为此有必要加紧研究探索RIRI的发生机制、发展过程以及最终转归，为临床治疗各种RIRI疾病提供有力的理论依据和更有效的治疗方法。

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