蒙药其察日嘎纳对抑郁大鼠海马S100β 蛋白表达的影响△

支小军 韩丽莎 韩 喆 刘 佳 宋 芳 胡 海 左春发

(1.包钢医院，内蒙古 包头 014040；2.包头医学院基础学院，内蒙古 包头 014040；3.包头市第四医院，内蒙古 包头 014040；4.包头医学院2008 级临床本科班，内蒙古 包头 014040)

抑郁症发病原因复杂，缺乏有效的治疗是当前急待解决的问题。神经影像学发现患者脑海马部位密度下降，神经元的树突减少和神经元坏死。脑海马与情绪和认知关系密切，与抑郁障碍的关系受到关注［1］。在海马神经胶质细胞中S100β(酸性钙结合蛋白)是脑神经胶质细胞完整性的特异标记蛋白，对神经系统损害反应极为敏感［2］。本研究应用慢性不可预知的温和应激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)建立抑郁模型，观察蒙药其察日嘎纳对抑郁大鼠抑郁程度、脑海马S100β 蛋白表达的干预作用，揭示蒙药对抑郁症的作用机制，为深入研究和防治提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料: 河北康派中药材有限公司提供内蒙产蒙药其察日嘎纳果实，批号: 103151 ，粉碎后全成分入药，生理盐水配制为10%浓度，4℃冰箱贮存备用。

1.2 分组及实验方法: Wistar 成年大鼠36 只，包头医学院动物室提供，雌雄各半，体重150 ～255g。适应性喂养1w后根据体重随机分为对照组、模型组、蒙药组(抑郁模型+药物)，每组12 只。对照组不予任何刺激，模型组、蒙药组接受5w 的CUMS 建立抑郁模型。第6w 蒙药组其察日嘎纳每日灌胃1 次，O.1g/100g 体重;模型组及对照组灌服等量生理盐水。

1.3 抑郁模型建立: 接受CUMS 的大鼠每日随机给予一种刺激: 禁食(24h)、禁水(24h)、倾斜笼子(45 度斜，24h)、夹尾(1min)、束缚(8min)、电击足底(电流1mA，每次持续5s，共15 次)，摇晃(1 次/s，5min)、噪音(5min)，共5w，相同的刺激不连续出现。

2 检测指标

实验11w，进行抑郁程度检测、免疫组化染色观察海马S100β 蛋白的表达。

2.1 抑郁程度检测

2.1.1 Open- Field 实验: 安静环境将大鼠放入80cm ×80cM 的开阔箱的中央格，开始计时。记录大鼠5 min 内行为，每只大鼠仅做1 次开阔箱行为测定。观察指标: 穿格次数(三爪以上跨入邻格的次数);理毛时间(前肢向上抬举，洗脸、抓痒，舔足时间);站立次数。

2.1.2 tail–puspension 实验: 用粘膏条在距尾尖2 cm 处将大鼠尾粘在一侧悬绳的下端，鼠头部离地面30 cm ，记录鼠在3 分钟内的悬尾不动时间、扭体次数。

2.2 海马S100β 蛋白表达

2.2.1 取材及免疫组化: 大鼠1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(1mL/kg)，腹主动脉、下腔静脉插管，37℃0.9%的生理盐水200 ml 快速灌注冲洗，37℃10%甲醛溶液400 mL 先快后慢进行冲洗，开颅取脑海马，4%多聚甲醛溶液固定48 h，梯度酒精脱水，透明，包埋，冠状切片(片厚约10μm)。常规二甲苯脱蜡乙醇水化，DAB 显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片。试剂: ①鼠抗S100B 单克隆抗体 浓缩型0.1 mL，克隆号SH -B1，工作浓度为1 B100;②DAB试剂盒显色染色和切片由武汉博士德生物工程有限公司完成。

2.2.2 结果判定: 对各组切片(每组取3 张)染色阳性细胞进行计数。每组海马各区分别随机选10 个视野，取平均值。每个点取3 张片，每片取连续不重复的10 个视野，平均计数阳性细胞。

2.2.3 图像分析: 麦克奥迪图像分析系统，观察平均灰度、平均光密度及面密度，灰度和光密度显示染色强度，面密度显示阳性面积。每张切片在40 倍物镜下测量海马CA1 区、CA2 区、CA3 区、CA4 区和DG 区［3］，取平均值反映切片值。

3 统计处理

数据以s 表示，用统计学软件SPSS 11. 0 进行分析，两样本均数比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

4 结 果

4.1 动物模型界定: CUMS 刺激5w，大鼠表现为倦怠、对外界刺激反应迟缓、活动范围缩小、饮水和摄食减少。在给予刺激后第5w 取24h 尿，化学发光法测定测定尿皮质醇水平(nmol/24h): 模型组(38.1 ±10.9)、药物组(37.9 ±9.2)，均明显高于对照组(32.2 ± 9.6)(P＜0.05)，提示大鼠处于抑郁状态，动物模型建立。

4.2 抑郁程度比较: 药物组与模型组比较: 穿格次数和站立次数明显增加(P ＜O.05)，其他指标无明显统计学差异，结果见表1。

表1 Open- Field 实验、tail -puspension 实验(s)

4.3 海马S100β 蛋白表达: 对照组S100β 蛋白阳性细胞胞体小，呈圆形或卵圆形，胞有突起，呈放射状，散在分布，胞浆呈棕褐色(图1)。模型组与对照组比较，海马S100β阳性细胞体积增大，染色较深(图2)，S100β 免疫反应产物阳性细胞计数值(31.74 ±4.56)较对照组(26.13 ±4.52)显著增高(P＜0.05)。药物组与模型组比较，S100β 阳性细胞体积缩小，染色变浅(图3)，S100β 免疫反应产物阳性细胞计数值(27.03 ±5.41)较模型组(31.74 ±4.56)显著减少(P＜0.05)。

大鼠海马S100B 表达的平均灰度值比较，对照组138.8±9.1，模型组S100B 阳性信号有所增强，灰度值为119.5±13.2，两组比较有显著差异(P＜0.01);药物组灰度值为120.5 ±11.2，与模型组119.5 ±13.2 比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

图3 药物组

图1 -3 各组S100B 的表达(IHC×400)

图1 对照组

图2 模型组

5 讨 论

脑内生理量的S100β 主要由星形胶质细胞产生，作用于神经元及w 围生长环境，调节细胞生长、能量代谢和参与细胞内信号转导，因此，可视为星形胶质细胞合成并分泌的一种神经营养因子，在神经元发育和损伤时维持其活力，对脑组织损伤起保护性作用［4］。正常情况下，脑内S100β 蛋白少量表达，中枢神经系统受损时水平上调，表明星形胶质细胞被激活，被认为星形胶质细胞的分子标记物之一，也被作为脑损伤的一种标记物［5］。S100β 蛋白对细胞功能的调节作用依赖于浓度水平，低浓度神经营养和保护作用，高浓度可引起神经元变性和诱导细胞凋亡［6］。

本实验结果显示，模型组大鼠慢性应激5w 后抑郁程度增加，海马S100β 阳性细胞体积增大，染色变深，S100β 免疫反应产物阳性细胞计数值显著增高，表明海马作为情绪和行为调节的高级中枢，与应激反应、抑郁症的发生密切相关。发生的机制可能与CUMS 使胶质细胞大量活化，干扰了神经元之间、神经元与胶质细胞间的正常联系，致神经元变性、细胞凋亡有关［7］;而胶质细胞作为神经免疫细胞被激活，产生释放许多细胞因子，引起机体内环境的变化，影响抑郁大鼠的行为能力。

药物组大鼠抑郁症状减轻，可能与蒙药其察日嘎纳使S100β 阳性细胞体积缩小，染色变浅，S100β 免疫反应产物阳性细胞计数值显著减少有关。而其作用的机制与其察日嘎纳所含总黄酮及有效成分能直接清除氧自由基和羟自由基，降低血压、降低血脂、降低血液粘稠度、抑制血小板聚集、软化血管、改善脑供血供氧［8］;其察日嘎纳所含的多种氨基酸，维生素、微量元素、不饱和脂肪酸(EPA、DHA)具有益智作用有关，其详细作用机理有待深入研究。

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