民间草药臭灵丹抑菌作用的实验研究△

2014-07-09吕跃军华木星龙海琼包赛朵

中国民族医药杂志 2014年9期

孙燕吕跃军华木星龙海琼包赛朵

( 大理学院基础医学院，云南大理 671003)

臭灵丹草Laggera pterodonta(DC.)Benth.为菊科六棱菊属翼齿六棱菊，别名狮子草、臭叶子、六棱菊等，主要分布于我国长江流域以南及西南部［1］。主要化学成分为桉烷型倍半萜和黄酮类化合物，具有抗菌消炎、清热解毒及抗肿瘤等作用［2］。臭灵丹在云南大理白族自治州各地均有分布。主要用于治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、咽喉炎、口腔炎、支气管炎、痈肿疥疮、烧烫伤、毒蛇咬伤、跌打损伤［3］。对臭灵丹乙醇提取物抑菌作用的研究尚未见相关报道。本文通过臭灵丹乙醇提取物抑菌作用的实验研究，比较臭灵丹茎、叶等不同部位的乙醇提取物对不同细菌的抑制效果，为臭灵丹药物疗效的进一步研究提供科学依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料: 臭灵丹购自昆明市官渡区绿生药业有限公司;金黄色葡萄球菌(S.aureus)铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、大肠埃希菌(E.coli)由大理学院病原生物学综合实验室提供。

1.2 试剂: 95%乙醇为分析纯(天津市化学试剂厂);MH(A)培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司);MH 肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司);氯化钠(原天津市化学试剂三厂)。

1.3 仪器: SY8200T 型超声波清洗器(上海声源超声波仪器设备有限公司);RE52 -3 型旋转蒸发器(上海泸西分析仪器有限公司);GHP-9160 型隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器科学有限公司);JJ -CJ -2FD 超净工作台(苏州市金净净化设备科技有限公司);YXQ -LS -50SII 型立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);DHP-9162 型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);JA3102 电子天平(上海海康电子仪器厂);DP04224 微量加样枪;50 分度游标卡尺。

2 实验方法

2.1 臭灵丹乙醇提取物制备: 称取臭灵丹粉末叶1400g、茎2000g，用95%乙醇(药材的10 倍量)超声波处理1h，静置5min，过滤，滤渣用95%乙醇(药材的2 倍量)超声波处理30min，静置5min，过滤，收集两次滤液，减压浓缩至无醇味。

在臭灵丹浓缩乙醇提取液中加入多倍量水稀释，放置4℃的冰箱6h 后过滤，沉淀物除去树脂，叶绿素等水不溶性杂质，减压浓缩得到流浸膏［4］，茎为106.10g，提取率为5.305%;叶为113.70g，提取率为8.121%。

以20%乙醇作溶剂溶解臭灵丹乙醇提取物茎、叶，配制成所需浓度［5］。

2.2 菌悬液的制备: 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌分别接种于MH 琼脂平板培养基中，于37℃恒温箱中培养24h，用接种环取琼脂平板上活化的单个菌落，用5 ～6mL 生理盐水校正浓度至0.5 麦氏比浊单位。

2.3 滤纸扩散实验研究臭灵丹相对抑菌活性: 用轧孔器在定性滤纸上轧成直径为6mm 的小圆片数片，于120℃条件下高压灭菌20min。取圆形灭菌滤纸片放入分别装有臭灵丹茎(1g/mL)、叶(1g/mL)提取液及20%乙醇的试管中浸润，用无菌镊子取出含药滤纸片放入培养皿于恒温箱中烘干5min，备用。

各菌种设2 个平行组，臭灵丹茎、叶两组为实验组，不含药液的溶剂为对照组。用无菌棉签取已配制好的菌悬液，于MH 琼脂平板上作来回连续划线，使其密集而均匀地涂布于整个平板表面，置室温3 ～5min 后。用无菌镊子分别取实验组及对照组含药纸片呈对称三角形贴于细菌平板上。同法取其他细菌各做1 份，并在平板底面玻璃上注明细菌及药物名称，于37℃恒温箱培养24h 后观察并记录结果。

2.4 试管稀释法测量臭灵丹对测试菌的最低抑菌浓度(MIC): 各菌种设两个平行组，实验组为臭灵丹茎、叶醇提物两组，对照组为不含药液的溶剂，取10 支试管为一组，编为1 ～10 号，每支试管加入2mLMH 肉汤培养基，在茎组、叶组、对照组1 号试管中分别加入2mL 的4g/mL、2g/mL 制备药液及20%乙醇溶液，混匀后分别吸取2mL 至2 号试管，以此类推加至8 号试管，吸取2mL 弃去。9 号试管为不含药液的测试菌生长对照，10 号试管为不含菌液的阴性对照。茎组1 ～8 号试管药液浓度分别为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156g/mL;叶组1 ～8 号试管药液浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078g/mL。用微量加样器分别取0.1mL 菌悬液依次加到由低浓度药液到高浓度药液的各试管中(同法用于各菌)。将每组试管置于37°C 恒温箱中培养24h，未见细菌生长的为最低抑菌浓度(MIC)。

3 结果与讨论

3.1 臭灵丹醇提物的抑菌作用: 见表1。

表1 臭灵丹提取物平均抑菌圈直径( ±s，mm n=5)

组别金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌茎醇提物8.916 ±0.113 7.916 ±0.466 6.506 ±0.128叶醇提物 12.712 ±1.008 7.868 ±0.185 6.730 ±0.073溶剂对照组6.706 ±0.087 6.222 ±0.041 6.276 ±0.043

对金黄色葡萄球菌: 茎组和乙醇溶剂组的抑菌圈直径差别有统计学意义(P＜0.05);茎组抑菌圈直径均值更大(8.92mm ＞6.71mm)，有显著抑菌作用;叶组和乙醇溶剂组抑菌圈直径差别有统计学意义(P＜0.05)且叶组抑菌圈直径均值更大(12.71mm ＞6.71mm)，有显著抑菌作用;茎组和叶组抑菌圈直径差别有统计学意义(P＜0.05)且叶组抑菌圈直径均值更大(12.71mm ＞8.92mm)，叶醇提物抑菌作用比茎更明显。

对铜绿假单胞菌: 茎组和乙醇溶剂组抑菌圈直径差别有统计学意义(P＜0.05)茎组抑菌圈直径均值更大(7.92mm ＞6.22mm)，具有显著抑菌作用;叶组和乙醇溶剂组抑菌圈直径差别有统计学意义(P＜0.05)，叶组的抑菌圈直径均值更大(7.87mm ＞6.22mm)，具有显著抑菌作用;茎组和叶组抑菌圈直径差别无统计学意义(P=0.798 ＞0.05)，茎、叶醇提物抑菌作用无显著性差异。

对大肠埃希菌: 茎组和乙醇溶剂组的抑菌圈直径差别有统计学意义(P=0.01 ＜0.05)且茎组抑菌圈直径均值更大(6.51mm ＞6.28mm)，茎醇提物具有显著抑菌作用;叶组和乙醇溶剂组抑菌圈直径差别有统计学意义(P＜0.05)且叶组抑菌圈直径均值更大(6.73mm ＞6.28mm);叶醇提物具有显著抑菌作用;茎组和叶组抑菌圈直径差别有统计学意义(P=0.02 ＜0.05)且叶组抑菌圈直径均值更大6.73mm ＞6.51mm。叶醇提物抑菌作用比茎更明显。

3.2 茎、叶提取物对3 种菌的最小抑菌浓度(MIC): 在茎组实验中，金黄色葡萄球菌的澄清管为1 ～2 号，混浊管为3 ～9 号，MIC 为2 号管浓度，即为1g/mL;铜绿假单胞菌的澄清管为1 ～2 号，混浊管为3 ～9 号，MIC 为2 号管浓度，即为1g/mL;大肠埃希菌的澄清管为1 号，混浊管为2 ～9号，MIC 为1 号管浓度，即为2g/mL。

在叶组实验中，金黄色葡萄球菌的澄清管为1 ～4 号，混浊管为5 ～9 号，MIC 为4 号管浓度，即为0.125g/mL;铜绿假单胞菌的澄清管为1 ～2 号，混浊管为3 ～9 号，MIC 为2 号管浓度，即为0.5g/mL;大肠埃希菌的澄清管为1 ～2号，混浊管为3 ～9 号，MIC 为2 号管浓度，即为0.5g/mL。

在乙醇溶剂对照组实验中，仅金黄色葡萄球菌的1 号管与铜绿假单胞杆菌的1 号管曾出现过澄清溶液，其余管溶液皆混浊。因此，能进一步支持本实验忽略溶剂对抗菌效果测定的干扰。