iNOS对兔角膜碱烧伤后新生血管形成的影响

修立恒 刘洪涛 曾小平

角膜的透明性是细胞结构和层次交错排列平衡的直接结果[1]，也是促进和抑制新生血管形成因子之间调节平衡的间接作用结果。已有研究表明血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)等均在新生血管形成过程中有着重要作用[2-3]。而病理情况下NO主要是由诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)催化合成，并且还发现氨基胍为一种相对选择性iNOS抑制剂，能够特异性抑制iNOS的表达[4]。本实验通过兔眼碱烧伤建立角膜新生血管模型，采用免疫组织化学法检测iNOS、VEGF在兔角膜碱烧伤后不同时间段的表达，以探讨iNOS对角膜碱烧伤后新生血管形成的影响。

1 材料与方法

1.1材料健康新西兰大白兔30只，雌雄兼备，体质量2.0～2.5 kg，由重庆市腾鑫比尔动物有限公司提供，裂隙灯下检查无眼表疾病。氨基胍(美国Sigma公司)，复方托吡卡胺眼液(参天制药株式会社)，妥布霉素眼液(美国Alcon公司)，小鼠抗兔VEGF单克隆抗体、免疫组织化学兔鼠通用型二抗试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，小鼠抗兔iNOS单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1角膜碱烧伤新生血管模型的制备30只大白兔均选取右眼为实验眼，用30 g·L-1的戊巴比妥钠按1 mL·kg-1的剂量从兔耳缘静脉缓慢注射，待全身麻醉成功后，再用丙美卡因眼液滴右眼局部麻醉，开睑器开睑，棉签吸干眼表多余的液体后，将直径为8 mm的浸有1 mol·L-1NaOH的无菌圆形滤纸，放于角膜中央1 min，快速用生理盐水充分冲洗结膜囊及眼表2 min，建立角膜碱烧伤模型。建模后局部予以氧氟沙星眼膏和复方托吡卡胺滴眼预防睑球、虹膜感染及粘连。建模成功标准：角膜水肿，明显混浊，基质层受损，虹膜仍隐约可见。术后角膜感染、穿孔的均不纳入实验观察范围。建模成功后随机均分为两组，每组各15只。术后第1天开始每天实验组、对照组分别予以5 g·L-1氨基胍液(0.25 g氨基胍溶于50 mL磷酸钠缓冲液)和磷酸钠缓冲液滴右眼，每天4次；此外，两组均用妥布霉素眼液滴右眼，每天4次；复方托吡卡胺眼液滴右眼，每天2次。

1.2.2角膜新生血管的观察与测量方法建模后每天观察角膜新生血管生长情况，分别在碱烧伤后第4天、第7天、第14天时随机选取5只兔右眼拍照，测量并记录角膜新生血管长度(以连续弯曲度小且朝向角膜中心生长的最长血管的垂直长度为准)，计算实验组和对照组角膜新生血管面积均按Robert电脑教学模型公式：S=C/12×3.14×[r2-(r-l)2][5]，其中r为角膜半径，C为新生血管累及角膜的圆周钟点数，l为角膜新生血管的长度。

1.2.3HE染色及免疫组织化学检测iNOS、VEGF的表达分别于烧伤后第4天、第7天、第14天随机选取5只兔子用空气栓塞的方法处死，无菌条件下剪下带1 mm宽巩膜的角膜组织(含角膜缘)，将标本固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液中12 h后，常规石蜡包埋，将包埋好的组织块平行于角膜表面连续厚4 μm切片。常规HE染色。免疫组织化学染色检测iNOS、VEGF蛋白的表达：常规脱蜡至水，蒸馏水Ⅰ、Ⅱ涮洗各5 min，放入柠檬酸盐抗原修复液(pH 6.0)中，微波中火修复10 min，PBS冲洗5 min×3次；滴加血清封闭20 min，分别滴加25 μL小鼠抗兔VEGF单克隆抗体稀释液(1350)和小鼠抗兔iNOS单克隆抗体稀释液(1200)覆盖组织，4 ℃过夜湿盒孵育18 h。次日，室温下PBS冲洗5 min×3次；滴加25 μL兔鼠通用型二抗室温湿盒孵育15 min，PBS冲洗5 min×3次。DAB显色30 s自来水终止，苏木素复染5 min，脱水透明烘干后中性树胶封片，光学显微镜下观察各组角膜组织中iNOS、VEGF表达的差异。实验结果判定：细胞浆或细胞膜出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。用IPWIN60软件的免疫组织化学图像自动分析模块的Image-Pro Plus图像分析系统对每组拍到的图像中阳性反应部位(胞浆或胞膜)进行分析，测得IOD(sum)值，IOD值越大，表示阳性表达越多。

2 结果

2.1碱烧伤后裂隙灯下观察结果碱烧伤后兔眼分泌物多且角膜炎症反应严重，碱烧伤后第1天仅可见角膜缘血管网充盈，无新生血管长入角膜上；伤后第2天角膜缘开始出现新生血管；伤后第4天角膜新生血管粗大且密集，呈毛刷状；伤后第7天角膜缘发现新生血管较第4天时稀疏但长度增加；伤后第14天角膜新生血管更稀疏且向角膜上延伸更长。

2.2角膜新生血管面积伤后第4天、第7天、第14天实验组角膜新生血管面积分别为：(50.18±1.60)mm2、(86.53±2.27)mm2、(108.31±2.01)mm2；对照组角膜新生血管面积为(70.04±2.85)mm2、(116.34±2.02)mm2、(151.40±0.58)mm2；在碱烧伤后3个时间点实验组较对照组新生血管面积均显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.3HE染色通过HE染色观察兔眼碱烧伤后各时间点角膜组织的形态发现：对照组较实验组角膜组织炎症细胞浸润更严重，新生血管更密集，新生血管管腔更粗大，基质层胶原纤维断裂溶解更多。

2.4角膜组织iNOS、VEGF的免疫组织化学结果分析iNOS、VEGF主要在新生血管内皮细胞及炎症细胞胞浆、胞膜表达。碱烧伤后第4天，iNOS、VEGF表达量达到峰值，随时间点推移呈逐渐下降趋势。伤后第4天、第7天、第14天实验组角膜组织iNOS、VEGF的IOD值均较对照组显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05，见表1-表2，图1-图2)，且iNOS与VEGF表达呈显著正相关(r=0.998，P<0.05)。

Figure 1 Corneal iNOS immunohistochemical expression at different time in two groups (×400).A:The 4th day after alkali burn in experimental group;B:The 7th day after alkali burn in experimental group;C:The 14th day after alkali burn in experimental group;D:The 4th day after alkali burn in control group;E:The 7th day after alkali burn in control group;F:The 14th day after alkali burn in control group 两组碱烧伤后不同时期角膜iNOS免疫组织化学表达的情况(×400)。A：实验组碱烧伤后第4天；B：实验组碱烧伤后第7天；C：实验组碱烧伤后第14天；D：对照组碱烧伤后第4天；E：对照组碱烧伤后第7天；F：对照组碱烧伤后第14天

Figure 2 Corneal VEGF immunohistochemical expression at different time in two groups (×400).A:The 4th day after alkali burn in experimental group;B:The 7th day after alkali burn in experimental group;C:The 14th day after alkali burn in experimental group;D:The 4th day after alkali burn in control group;E:The 7th day after alkali burn in control group;F:The 14th day after alkali burn in control group 两组碱烧伤后不同时期角膜VEGF免疫组织化学表达的情况(×400)。A：实验组碱烧伤后第4天；B：实验组碱烧伤后第7天；C：实验组碱烧伤后第14天；D：对照组碱烧伤后第4天；E：对照组碱烧伤后第7天；F：对照组碱烧伤后第14天

表1 角膜碱烧伤后不同时期VEGF的IOD值比较

表2 角膜碱烧伤后不同时期iNOS的IOD值比较

3 讨论

新生血管在角膜上存在的方式有3种：后弹力层新生血管、基质层新生血管和角膜血管翳[6]。从形态学上将伤后角膜新生血管的生成分为3个时期：非增殖期，仅角膜缘血管网扩张，角膜上无新生血管；血管增殖期，新生血管生长最快，角膜上新生血管粗密呈毛刷状；血管退行期，新生血管生长停滞，血管变得稀疏[7]。目前对于角膜新生血管的治疗方法主要有：类固醇激素、非甾体类抗炎药、VEGF拮抗剂、环孢素、实验性基因、激光和外科手术治疗等[8]。

对于角膜新生血管的形成有如下学说：缺氧学说、细胞因子平衡学说、白细胞介导学说和炎症学说等[9]。角膜新生血管化是多种因素共同作用的结果，主要是细胞因子失衡造成的。即角膜新生血管化是促进和抑制新生血管形成因子之间调节失衡引起促进新生血管形成因子过剩和抑制新生血管形成因子缺乏的结果[10]。VEGF在新生血管形成中起核心作用，NO、HIF等已经被证实与新生血管形成相关[2-3]。虽然VEGF和NO等都在角膜新生血管生成过程中起到一定的作用，但是其参与这一过程的具体机理还不清楚[11]。常岩等[12]通过建立兔角膜碱烧伤模型用浓度为 5 g·L-1的Avastin眼液治疗兔角膜碱烧伤，结果显示抑制新生血管效果明显，表明VEGF的表达水平与新生血管的形成密切相关。刘晓坤等[7]通过实验证明NO能促进碱烧伤后角膜新生血管生长，还发现VEGF与NO在促角膜新生血管形成方面具有协同作用。而NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化合成，目前发现至少存在3种NOS：内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和iNOS，iNOS主要表达于炎症激活的细胞因子及免疫细胞，其催化合成的NO是介导病理过程的重要调节因子。同时人们又发现氨基胍做为一种相对选择性iNOS抑制剂，能够特异性抑制iNOS，却不会阻断NOS催化合成NO来维持血管舒张状态方面的功能[4]。

本实验通过裂隙灯显微镜、角膜组织HE染色和免疫组织化学方法来观察兔眼角膜碱烧伤后角膜新生血管的变化并进一步分析碱烧伤后角膜组织中VEGF、iNOS的表达与角膜新生血管生长的关系，结果表明角膜新生血管形态变化和生长速度与角膜组织VEGF、iNOS的表达变化相一致。同时发现碱烧伤后VEGF、iNOS的表达既从角巩膜缘向角膜中央发展，也从角膜上皮层向角膜基质层发展，这些都与裂隙灯下观察兔眼碱烧伤后角膜新生血管的生长情况相符合。在烧伤早期VEGF、iNOS大量表达，血管生长速度很快，后期表达显著降低，血管生长速度也相应减慢。由此可见VEGF、iNOS对新生血管生长不仅在早期有诱导作用，还有后续促进作用。所以VEGF、iNOS与角膜新生血管的形成及生长关系密切。实验组使用5 g·L-1的氨基胍眼液治疗后，新生血管面积较对照组显著降低，VEGF、iNOS蛋白的IOD值也较对照组显著降低，表明氨基胍作为一种选择性iNOS抑制剂在抑制角膜新生血管生长方面有显著疗效。由于iNOS通过合成NO来发挥生物学效应，表明VEGF和NO参与新生血管形成的过程，可能对新生血管生长起促进作用，也进一步说明VEGF和iNOS都可能参与角膜新生血管形成。

同时本实验结果发现兔眼碱烧伤后3个时间点角膜组织中VEGF和iNOS蛋白表达量呈显著正相关，说明二者在促角膜新生血管形成过程中呈协同作用。而实验组在碱烧伤后3个时间点角膜新生血管面积较对照组显著降低，说明氨基胍可能通过抑制iNOS的表达来降低伤后角膜组织中NO的含量，进而抑制角膜新生血管生长。

综上所述，本实验说明VEGF和iNOS在促进角膜新生血管形成方面呈协同作用，同时氨基胍对于防治角膜新生血管的生成和促进受损角膜恢复透明有一定的作用，为角膜新生血管治疗方面的研究提供了新的思路。但是氨基胍应用的安全性尚需进一步深入研究，以期为临床病理状态下角膜新生血管防治工作开辟更广阔的前景。

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