Avastin对翼状胬肉成纤维细胞增殖的影响△

刘祎 沙翔垠 彭娟 文晔 宋莉

翼状胬肉是一种常见的球结膜纤维血管组织侵犯角膜的眼表疾病，目前广泛认可其发病与长期暴露于紫外线有关[1]。近期通过细胞分子生物技术，证明了其机制涉及基因成分、抗凋亡机制、细胞因子、生长因子、细胞外基质重塑、免疫和病毒感染等[2]。翼状胬肉的病理表现是纤维血管组织的增生[3]，其形成和发展都需要新生血管的参与，这说明生长因子可能是翼状胬肉发生发展的直接或间接病因。有人提出翼状胬肉发生的原因之一是由于血管生成刺激和抑制调节的失衡[4]。而VEGF又是最重要的血管生成调节因子之一，这就使药物能在分子水平抑制血管及细胞增殖，进而成为抑制翼状胬肉的生长及复发的一个新的治疗方向。Avastin 是重组人源化单克隆 IgG1抗体，它可与VEGF-A结合，阻断VEGF-A与受体Flk-1、KDR的信号转导，抑制人体内外VEGF的生物活性。Avastin目前已被用于玻璃体内注药治疗一些新生血管增生性疾病，例如年龄相关性黄斑病变、增生性糖尿病视网膜病变以及新生血管性青光眼，并且具有良好的耐受性及视力改善[5-6]，因此我们猜测，Avastin对翼状胬肉的治疗也具有安全性及临床有效性。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本收集选择2012年6月至2013年6月在我院治疗的原发翼状胬肉患者50例，手术室无菌条件下取下的翼状胬肉标本，均位于鼻侧，患者年龄24～65岁，平均年龄48.1；男性27例，女性23例。纳入标准：(1)按照诊断标准确诊为原发性翼状胬肉；(2)翼状胬肉头部侵入角膜2～5 mm；(3)患者同意手术治疗并签订手术同意书。排除标准：(1)既往有眼部手术史；(2)有活动性眼部炎症性病变；(3)复发性、假性翼状胬肉。

1.1.2试剂和仪器DMEM/F12培养基、双抗(Hyclone，美国Thermo公司)，胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，Avastin、LDH检测试剂盒及WST-1试剂、酶标仪(美国Thermo公司)，电泳仪(美国BIO-RAD公司)，倒置相差显微镜(日本Nikon公司)，p-CyclinD1、t-CyclinD1、Caspase3抗体(美国CST公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养和分离无菌条件下将翼状胬肉组织块放入培养皿，PBS清洗3次，剪成1 mm×1 mm组织块，将组织块接种于6孔板，3～4 d可见有梭形细胞从组织块周边爬出，待长满后消化，接种于培养瓶，每2～3 d换液1次。

1.2.2细胞生长曲线测定取对数生长期细胞接种于96孔板(每孔100 μL，接种密度为20×103mL-1)，分为正常组(无处理)、Avastin组(2.50 g·L-1Avastin处理)。细胞贴壁后更换无血清培养基饥饿24 h，然后更换体积分数10%FBS培养基，加药12 h、24 h、48 h、72 h，进行WST-1实验，以光密度(OD值)为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线。

1.2.3WST-1检测细胞增殖抑制取对数生长期的细胞接种于96孔板(每孔100 μL，接种密度为20×103mL-1)，每板设空白对照组(无细胞)、细胞对照组(有细胞无处理)以及5个Avastin浓度组(0.25 g·L-1、0.50 g·L-1、1.00 g·L-1、1.50 g·L-1、2.50 g·L-1)，每个浓度组设3个复孔，细胞贴壁后更换无血清培养基饥饿24 h，然后更换体积分数10%FBS培养基，分别于加药12 h、24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL WST-1溶液，避光2 h，振荡10 s，酶标仪450 nm波长检测光密度(OD)值，根据公式计算抑制率：细胞增殖抑制率=[1-(实验组OD值-空白对照组OD值)/(细胞对照组OD值-空白对照组OD值)]×100%。

1.2.4LDH试剂盒检测细胞毒性取对数生长期的细胞接种于96孔板(每孔100 μL，接种密度为 20×103mL-1)，每板设空白组、细胞对照组、样品最大酶活性对照组以及5个Avastin浓度组(浓度同1.2.3)，每组浓度设3个复孔，细胞贴壁后更换无血清培养基饥饿24 h，然后更换体积分数1%FBS培养基，分别于12 h、24 h、48 h、72 h加药，处理结束后根据试剂盒说明操作，酶标仪490 nm波长检测光密度(OD)值，根据公式计算抑制率：细胞毒性或死亡率=(处理样品OD值-样品对照孔OD值) /(样品最大酶活性组OD值-样品对照孔OD值)×100 %。

1.2.5Westernblot方法检测p-CyclinD1、t-CyclinD1、Caspase3的表达分为细胞对照组以及5个Avastin浓度组(浓度同1.2.3)，加药72 h后，充分裂解细胞提取上清蛋白，BCA法检测蛋白浓度，每孔上样20 μg蛋白总量，电泳后转至20 μm孔径的PVDF膜，BSA封闭30 min后，4 ℃孵育一抗14 h，然后常温孵育二抗1 h，显影剂曝光条带。

2 结果

2.1翼状胬肉成纤维细胞生长曲线测定图1可见，加药后12 h和24 h时，2.50 g·L-1Avastin组与正常组相比光密度差异无统计学意义(P=0.172、P=0.153)；48 h及72 h Avastin组曲线则上升缓慢，与正常组相比光密度差异有统计学意义(P=0.034、P=0.016)。

2.2对翼状胬肉成纤维细胞增殖的抑制作用Avastin随药物浓度的增加以及作用时间的延长，其抑制作用增强，尤其当浓度>1.00 g·L-1，时间>24 h时，抑制作用明显增强(表1)。与12 h相比，0.25 g·L-1Avastin组及0.50 g·L-1Avastin组作用24 h、48 h、72 h后细胞增殖抑制率无明显提高(均为P>0.05)，1.50 g·L-1Avastin组及2.50 g·L-1Avastin组作用48 h、72 h后细胞增殖抑制率均明显提高(均为P<0.05)。与0.25 g·L-1Avastin组相比，0.50 g·L-1Avastin组在各个时间点(除12 h外)细胞增殖抑制率均无明显提高(均为P>0.05)，1.50 g·L-1Avastin组、2.50 g·L-1Avastin组在各个时间点抑制率均明显提高(均为P<0.05)。

Figure 1 Growth curve of HPF of two groups 正常组以及Avastin组细胞的生长曲线

表1 贝伐单抗对成纤维细胞的抑制率

2.3Avastin对翼状胬肉成纤维细胞的细胞毒性

图2示各浓度Avastin组在 12 h、24 h、48 h、72 h对翼状胬肉成纤维细胞LDH释放较最大释放组(加入裂解酶)均小于20%甚至为负值，因此评价Avastin呈低细胞毒性或无细胞毒性。Avastin各浓度组与LDH最大释放组对翼状胬肉成纤维细胞LDH释放率差异均有统计学意义(均为P<0.05)，同时间点Avastin各浓度组间、不同时间点同一浓度Avastin组间比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

Figure 2 Cytotoxicity of Avastin on HPF Avastin对翼状胬肉成纤维细胞的细胞毒性

2.4Avastin对细胞蛋白表达的影响由图3可见，随着Avastin浓度的增高，与细胞对照组相比，p-CyclinD1蛋白表达均下降(均为P<0.05)，呈浓度依赖性；但t-CyclinD1的表达没有明显变化(均为P>0.05)，Caspase3的表达升高(均为P<0.05)，但未观察到明显浓度效应。

Figure 3 Expression of p-cyclinD1,total-cyclinD1 and Caspase 3 detected by Western blot (Compared with control,*P<0.05) Western blot检测蛋白p-CyclinD1、t-CyclinD1、Caspase3的表达(与细胞对照组相比，*P<0.05)

3 讨论

既往认为VEGF主要是通过作用于血管内皮细胞从而抑制新生血管生长而发挥抗增殖作用，但是现研究表明VEGF及其受体除了在血管内皮细胞表达外，多种眼组织细胞如视网膜神经节细胞、脉络膜内皮细胞、角膜内皮细胞、角膜上皮细胞、成纤维细胞等也存在VEGF的自分泌以及其受体的表达[2，7-8]，提示在翼状胬肉的发病机制中可能存在自分泌以及旁分泌的协同作用，因此阻断VEGF的信号通路可以多方面抑制眼表新生血管性疾病的进展。

翼状胬肉是眼科最常见影响视力的眼表增生性疾病，流行病学资料表明亚洲翼状胬肉患病率相当高[9]，我国成人10 a发病率为4.9%[10]，尤其在超过50岁人群中，发病率是33.0%[9]，其发病机制涉及多个方面。目前，临床上对翼状胬肉的治疗以手术切除为主，早期只做头部的简单切除，后来有学者提出暴露巩膜法可阻断残留组织的再生，然而，其术后复发率仍高达50.0%[11]，通过手术的改良、结膜瓣的转位、角膜缘干细胞移植、羊膜移植手术，可明显降低术后的复发，但仍有一定的复发率。因此解决胬肉术后复发是治疗该病的关键。

目前已有大量动物实验研究证实，贝伐单抗局部球结膜注射或滴眼治疗能够有效抑制角膜新生血管，并且对角膜上皮愈合无明显影响[12-13]。Mauro等[14]对初发以及复发的翼状胬肉患者结膜下注射Avastin 12周后观察到胬肉面积明显减小，并且未观察到与治疗相关的毒副作用。Ozgurhan 等[15]对术后胬肉复发2次患者的研究也显示Avastin局部滴眼可以有效减少新生血管形成，并且患者耐受性好。这些都证明了Avastin在治疗眼表新生血管性疾病方面有着良好的前景。在对眼表疾病和翼状胬肉的治疗中，局部球结膜注射或滴眼治疗就足以使药物到达病变部位，发挥疗效，避免了全身用药以及眼内注射的并发症发生。

本研究采用WST-1法测定Avastin对翼状胬肉成纤维细胞生长的影响，发现Avastin能够直接抑制翼状胬肉成纤维细胞增殖，当浓度为2.50 g·L-1时作用72 h抑制率为30.10%±1.11%，对翼状胬肉成纤维细胞具有明显的抑制作用。其机制尚需进一步研究，可能与阻滞细胞周期、加速细胞凋亡等密切相关。然后进一步通过对细胞释放到培养液中的LDH的活性检测揭示Avastin是否具有细胞毒性，Avastin呈低毒性或无毒性，部分低毒性结果可能与细胞自身代谢产生的LDH有关，故可推测Avastin对翼状胬肉成纤维无明显细胞毒性。Deissler等[16]证明Avastin和Lucentis对视网膜微血管内皮细胞均没有细胞毒性，Philipp等[8]证明Avastin对视网膜色素上皮细胞、视网膜节细胞、脉络膜内皮细胞均无细胞毒性，均证实Avastin的安全性。

本实验还通过Western blot法检测Avastin刺激后的细胞中p-CyclinD1、t-CyclinD1以及Caspase 3的表达，结果显示，Avastin可以浓度依赖性抑制p-CyclinD1的活化，但不引起t-CyclinD1蛋白的减少，并且引起Caspase3蛋白表达升高，故Avastin可以抑制细胞分裂，并增加细胞凋亡。CyclinD1是一种细胞周期蛋白，当生长因子如VEGF、bFGF等存在的条件下，可激活其与CDK4结合，形成CyclinD1/CDK4复合物，促进pRb的磷酸化并释放转录因子E2F，正向调节细胞增生。在正常细胞中CyclinD1参与细胞G1期，使细胞周期从G1期过渡到S期，当生长因子缺乏时，CyclinD1活化减少，G1期的细胞则会进入G0期(静止期)。Caspase3是参与细胞凋亡执行的一种凋亡蛋白，在细胞程序性死亡中起着至关重要的作用。

综上所述，Avastin对翼状胬肉成纤维细胞有显著的抑制增殖作用以及促凋亡作用，同样可以发现VEGF对成纤维细胞的生长起着重要的作用。因此，可为预防和治疗翼状胬肉提供新的理论依据，但还需进一步研究确认其对其他细胞信号通路、其他眼表细胞的作用，以及在眼部代谢的半衰期等，以确定有效的治疗浓度及最佳给药途径。

1 Threlfall TJ，English DR.Sun exposure and pterygium of the eye：a dose-response curve[J].AmJOphthalmol，1999，128(3)：280-287.

2 Di Girolamo N，Chui J，Coroneo MT，Wakefield D.Pathogenesis of pterygia：role of cytokines，growth factors，and matrix metalloproteinases[J].ProgRetinEyeRes，2004，23(2)：195-228.

3 Livezeanu C，Craitoiu MM，Manescu R，Mocanu C，Craitoiu S.Angiogenesis in the pathogenesis of pterygium[J].RomJMorpholEmbryol，2011，52(3)：837-844.

4 Azar DT.Corneal angiogenic privilege：angiogenic and antiangiogenic factors in corneal avascularity，vasculogenesis，and wound healing(an American Ophthalmological Society thesis)[J].TransAmOphthalmolSoc，2006，104：264-302.

5 Spaide RF，Fisher YL.Intravitreal bevacizumab(Avastin) treatment of proliferative diabetic retinopathy complicated by vitreous hemorrhage[J].Retina，2006，26(3)：275-278.

6 Rosenfeld PJ，Moshfeghi AA，Puliafito CA.Optical coherence tomography findings after an intravitreal injection of bevacizumab(avastin) for neovascular age-related macular degeneration[J].OphthalmicSurgLasersImaging，2005，36(4)：331-335.

7 Spitzer MS，Wallenfels-Thilo B，Sierra A，Yoeruek E，Peters S，Henke-Fahle S，etal.Antiproliferative and cytotoxic properties of bevacizumab on different ocular cells[J].BrJOphthalmol，2006，90(10)：1316-1321.

8 Philipp W，Speicher L，Humpel C.Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in inflamed and vascularized human corneas[J].InvestOphthalmolVisSci，2000，41(9)：2514-2522.

9 Wu K，He M，Xu J，Li S.Pterygium in aged population in Doumen County，China[J].YanKeXueBao，2002，18(3)：181-184.

10 Zhao L，You QS，Xu L，Ma K，Wang YX，Yang H，etal.10-year incidence and associations of pterygium in adult Chinese：the Beijing Eye Study[J].InvestOphthalmolVisSci，2013，54(2)：1509-1514.

11 Droutsas K，Sekundo W.Epidemiology of pterygium.A review[J].Ophthalmologe，2010，107(6)：511-512，514-516.

12 沙翔垠，宋莉.Avastin和地塞米松在大鼠角膜新生血管中的作用[J].眼科研究，2010，28(7)：591-595.

13 Papathanassiou M，Theodossiadis PG，Liarakos VS，Rouvas A，Giamarellos-Bourboulis EJ，Vergados IA.Inhibition of corneal neovascularization by subconjunctival bevacizumab in an animal model[J].AmJOphthalmol，2008，145(3)：424-431.

14 Mauro J，Foster CS.Pterygia：pathogenesis and the role of subconjunctival bevacizumab in treatment[J].SeminOphthalmol，2009，24(3)：130-134.

15 Ozgurhan EB，Agca A，Kara N，Yuksel K，Demircan A，Demirok A.Topical application of bevacizumab as an adjunct to recurrent pterygium surgery[J].Cornea，2013，32(6)：835-838.

16 Deissler HL，Deissler H，Lang GE.Actions of bevacizumab and ranibizumab on microvascular retinal endothelial cells：similarities and differences[J].BrJOphthalmol，2012，96(7)：1023-1028.