CD40—CD40L在儿童持续性免疫性血小板减少症发病机制中的作用研究

邓彩艳+马占敏+胡玉莲

[摘要] 目的 通过检测CD40-CD40L在持续性免疫性血小板减少症（Persistent ITP）患儿外周血单个核细胞中的表达情况，以揭示其在儿童持续性ITP发病机制中的作用。 方法 应用流式细胞术检测20例持续性ITP患儿治疗前后及20例对照组儿童外周血单个核细胞中CD40-CD40L的表达情况，用ELISA法检测血小板抗体（PAIgG）。 结果 与对照组比较，CD40和CD40L治疗前后的表达均增高（P<0.01，P<0.05），CD40治疗前高于治疗后（P<0.05），CD40L在两组的表达则差异无统计学意义（P>0.05）；CD40、CD40L的表达与PAIgG均呈正相关（r分别为0.713、0.746，P<0.05）。 结论 CD40-CD40L共刺激信号异常可能为儿童持续性ITP发病机制之一，阻断此共刺激途径可能获得较好的治疗效果。

[关键词] CD40；CD40L；免疫性血小板减少症；儿童；持续性；发病机制

[中图分类号] R593.2 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）07-61-03

The Effect of CD40 and CD40L in pathogenesis of children with persistent immune thrombocytopenia

DENG Caiyan MA Zhanmin HU Yulian

Department of Pediatrics， Zhengzhou Maternal and Child Health Hospital， Zhengzhou 450012， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of CD40 and CD40L in peripheral blood mononuclear cells of patients with childhood Persistent immune thrombocytopenia（Persistent ITP）， and to explore their possible roles in the pathogenesis of the disease. Methods The positivity rates of CD40 and CD40L in peripheral blood mononuclear cells were measured by flow cytometry in 20 Persistent ITP patients （prior treatment and post treatment） and 20 normal controls. Platelet-associated antibody（PAIgG） were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） technique. Results Compared with controls， the expression of CD40 and CD40L were higher in both prior treatment group and post treatment group（P<0.01，P<0.05）， Compared with post treatment group， the expression of CD40 in prior treatment group were higher（P<0.05=. The expression of CD40 and CD40L had positive correlation with PAIgG （r=0.713， 0.746； P<0.05）. Conclusion CD40 and CD40L pathway may play important roles in the pathogenesis of Persistent ITP， and it is possible to be a good therapeutic target if we can obstruct this way.

[Key words] CD40； CD40L； ITP； Children； Persistent； Pathogenesis

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是儿童时期常见的自身免疫出血性疾病，且近年来持续性和慢性ITP发病呈增多趋势，激素、免疫球蛋白等常规治疗效果差，不良反应多，病情迁延不愈，给家庭造成极大的心理和经济负担。大量研究证实，血小板抗体是导致血小板减少的关键因素。CD40-CD40L相互作用提供的共刺激信号可活化T、B淋巴细胞进而引起免疫反应，在血小板抗体的产生过程中可能起着重要作用。本研究通过应用流式细胞术检测持续性ITP患儿治疗前后外周血单个核细胞中CD40-CD40L的表达情况，并研究其与PAIgG产生的关系，为进一步研究ITP的发病机制和应用新的免疫治疗方法提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

治疗组为2011年1月～2013年7月住院的20例持续性ITP患儿，诊断均符合儿童持续性ITP诊断标准[1]，男14例，女11例，年龄4个月～11岁，平均年龄5.7岁，分别于治疗前后收集外周血标本2mL；对照组外周血标本20例，取自本院正常体检儿童，年龄6个月～11岁，男14例，女11例，平均年龄5.8岁。所有患儿及对照组家属均知情同意，两组年龄、性别比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂及仪器endprint

鼠抗人CD40-FITC、CD40L-PE均购自eBioscience公司，流式细胞仪 FACScan，美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 CD40、CD40L的检测 采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞，取100?L单个核细胞悬液分别加入含单克隆荧光标记抗体CD40-FITC、CD40L-PE各10μL的试验管中，混匀后20～25℃避光孵育20～30min，PBS液洗涤后上机检测，用CELL Quest软件分析。

1.3.2 PAIgG的检测 采用ELISA法，PAIgG含量测定试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司。

1.4 统计学分析

采用SPSS16.0统计软件进行分析，实验数据以（）表示，样本符合正态分布，组间比较用单因素方差分析，相关分析用Pearson线性相关分析方法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD40、CD40L的表达情况

（1）与对照组比较，CD40在治疗前和治疗后的表达均增高（t=8.327，P<0.01；t=5.549，P<0.05），CD40L在治疗前和治疗后的表达均增高（t=5.098，P<0.05；t=4.264，P<0.05）；（2）CD40在治疗前表达高于治疗后（t=3.363，P<0.05），CD40L治疗前后表达差异无统计学意义（t=0.758，P>0.05）。见表1。

表1 持续性ITP患儿外周血单个核细胞CD40、CD40L的表达情况（，%）

组别 例数 CD40 CD40L

治疗前 20 9.84±2.69*# 6.38±2.36▲

治疗后 20 8.27±1.87▲ 5.85±2.73▲

对照组 20 6.45±2.08 4.37±1.94

注：与对照组相比，*P<0.01，▲P<0.05；治疗前与治疗后比较，#P<0.05

2.2 与PAIgG的相关性分析

CD40、CD40L与PAIgG呈正相关（r分别为0.713、0.746，P<0.05）。

3 讨论

2009年美国血液学协会正式将特发性血小板减少性紫癜更名为免疫性血小板减少症，新标准根据病程分为三型：新诊断的ITP（Newly ITP）：即自诊断之日起，病程在3个月之内；持续性ITP（Persistent ITP）：病程3～12个月，包括未获得自发缓解或停止治疗后不能维持完全缓解的患者；慢性ITP（ Chronic ITP）：病程持续12个月以上。80%～90%的儿童ITP患者常于6个月内获得缓解[2]。ITP的发病机制复杂，目前认为与体液及细胞免疫紊乱、病毒及幽门螺杆菌感染、巨核细胞异常等多种因素有关。CD40-CD40L为体内特异性免疫系统重要的一对共刺激分子，在机体的体液免疫和细胞免疫反应中起重要作用，在自身抗体的形成中起重要作用，参与多种自身免疫性疾病的发病过程。在血小板抗体产生过程中，CD40/CD40L相互作用提供的共刺激信号在活化淋巴细胞进而引起免疫反应的过程中是必不可少的。研究证明ITP患儿体内存在T、B淋巴细胞的异常活化。

ITP的一线治疗目前仍是以肾上腺糖皮质激素和IVIG为主，但治疗效果并不理想，复发率高，且不能影响ITP的自然病程[3]。而达那唑、环孢素A、长春新碱等药物副作用大，疗效也并不理想。对于难治性ITP，脾切除术治愈率高，但存在严重出血风险，并需长期服用激素和其他免疫抑制剂，严重影响患儿的生活质量[4]。近年来对ITP发病机制的深入研究令许多定向免疫干预措施进入临床，如应用抗RhD免疫球蛋白减少单核-巨噬细胞对血小板的吞噬；应用抗CD20单抗抑制B淋巴细胞功能，减少自身抗体的产生；应用血小板生成素（TPO）类似物促进巨核细胞增殖及发育成熟，以及IFN2α、霉酚酸酯（MMF）、造血干细胞移植等方法，均取得了一定疗效[5-7]，但在儿童中的应用报道较少。

本实验结果表明CD40、CD40L在持续性ITP患儿治疗前后外周血单个核细胞的表达明显增高，且CD40、CD40L的表达与PAIgG呈正相关，提示CD40-CD40L在PAIgG的产生中起重要作用，其表达增高促进了自身反应性B淋巴细胞激活，从而产生大量抗血小板抗体，使血小板破坏增多并生成减少。治疗后CD40明显降低，而CD40L治疗前后比较差异无统计学意义，推测CD40L持续增高可能是少数持续性ITP患儿常规治疗效果欠佳的原因之一，阻断此通路可望减少自身抗体的产生，重建免疫稳态，为持续性ITP尤其是难治性ITP患儿的治疗提供一个新思路。

（下转第页）

（上接第页）

[参考文献]

[1] Rodeghiero F，Stasi R，Gernsheimer T，et al.Standardization of terminology， definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children： report from an international working group[J].Blood，2009，113：2386-2393.

[2] 盛光耀，翟慢慢.免疫性血小板减少症研究新进展[J].中国小儿血液与肿瘤杂志，2013，18（3）：97-99.

[3] Tarantino M.Recent advances in the treatment of childhood immune thrombocytopenic purpura[J].Sem in Hematol，2006，43（3 supp l5）：11-17.

[4] Kang CM，Lee JG，Kim KS，et al.Long-term follow-up of laparoscopic splenectomy in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].J Korean Med Sci，2007，22 （3）： 420-424.

[5] Zaja F，BaccaraniM，Mazza P，et al.A prospective randomized study comparing rituximab and dexamethasone vs dexamethasone alone in ITP： results of final analysis and long term follow up[J].Blood （ASH AnnualMeeting Abstracts） ， 2008， 112 （11）：1.

[6] Bussel JB，Kuter DJ，George JN，et al.AMG531，a thrombopoiesis- stimulating protein for chronic ITP[J].New Engl J Med，2006，355（16）：1672-1681.

[7] 王弘，吴琼，徐刚，等.霉酚酸酯治疗难治性特发性血小板减少性紫癜10例[J].实用儿科临床杂志，2010，25（3）：214-216.

（收稿日期：2013-12-11）endprint

鼠抗人CD40-FITC、CD40L-PE均购自eBioscience公司，流式细胞仪 FACScan，美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 CD40、CD40L的检测 采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞，取100?L单个核细胞悬液分别加入含单克隆荧光标记抗体CD40-FITC、CD40L-PE各10μL的试验管中，混匀后20～25℃避光孵育20～30min，PBS液洗涤后上机检测，用CELL Quest软件分析。

1.3.2 PAIgG的检测 采用ELISA法，PAIgG含量测定试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司。

1.4 统计学分析

采用SPSS16.0统计软件进行分析，实验数据以（）表示，样本符合正态分布，组间比较用单因素方差分析，相关分析用Pearson线性相关分析方法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD40、CD40L的表达情况

（1）与对照组比较，CD40在治疗前和治疗后的表达均增高（t=8.327，P<0.01；t=5.549，P<0.05），CD40L在治疗前和治疗后的表达均增高（t=5.098，P<0.05；t=4.264，P<0.05）；（2）CD40在治疗前表达高于治疗后（t=3.363，P<0.05），CD40L治疗前后表达差异无统计学意义（t=0.758，P>0.05）。见表1。

表1 持续性ITP患儿外周血单个核细胞CD40、CD40L的表达情况（，%）

组别 例数 CD40 CD40L

治疗前 20 9.84±2.69*# 6.38±2.36▲

治疗后 20 8.27±1.87▲ 5.85±2.73▲

对照组 20 6.45±2.08 4.37±1.94

注：与对照组相比，*P<0.01，▲P<0.05；治疗前与治疗后比较，#P<0.05

2.2 与PAIgG的相关性分析

CD40、CD40L与PAIgG呈正相关（r分别为0.713、0.746，P<0.05）。

3 讨论

2009年美国血液学协会正式将特发性血小板减少性紫癜更名为免疫性血小板减少症，新标准根据病程分为三型：新诊断的ITP（Newly ITP）：即自诊断之日起，病程在3个月之内；持续性ITP（Persistent ITP）：病程3～12个月，包括未获得自发缓解或停止治疗后不能维持完全缓解的患者；慢性ITP（ Chronic ITP）：病程持续12个月以上。80%～90%的儿童ITP患者常于6个月内获得缓解[2]。ITP的发病机制复杂，目前认为与体液及细胞免疫紊乱、病毒及幽门螺杆菌感染、巨核细胞异常等多种因素有关。CD40-CD40L为体内特异性免疫系统重要的一对共刺激分子，在机体的体液免疫和细胞免疫反应中起重要作用，在自身抗体的形成中起重要作用，参与多种自身免疫性疾病的发病过程。在血小板抗体产生过程中，CD40/CD40L相互作用提供的共刺激信号在活化淋巴细胞进而引起免疫反应的过程中是必不可少的。研究证明ITP患儿体内存在T、B淋巴细胞的异常活化。

ITP的一线治疗目前仍是以肾上腺糖皮质激素和IVIG为主，但治疗效果并不理想，复发率高，且不能影响ITP的自然病程[3]。而达那唑、环孢素A、长春新碱等药物副作用大，疗效也并不理想。对于难治性ITP，脾切除术治愈率高，但存在严重出血风险，并需长期服用激素和其他免疫抑制剂，严重影响患儿的生活质量[4]。近年来对ITP发病机制的深入研究令许多定向免疫干预措施进入临床，如应用抗RhD免疫球蛋白减少单核-巨噬细胞对血小板的吞噬；应用抗CD20单抗抑制B淋巴细胞功能，减少自身抗体的产生；应用血小板生成素（TPO）类似物促进巨核细胞增殖及发育成熟，以及IFN2α、霉酚酸酯（MMF）、造血干细胞移植等方法，均取得了一定疗效[5-7]，但在儿童中的应用报道较少。

本实验结果表明CD40、CD40L在持续性ITP患儿治疗前后外周血单个核细胞的表达明显增高，且CD40、CD40L的表达与PAIgG呈正相关，提示CD40-CD40L在PAIgG的产生中起重要作用，其表达增高促进了自身反应性B淋巴细胞激活，从而产生大量抗血小板抗体，使血小板破坏增多并生成减少。治疗后CD40明显降低，而CD40L治疗前后比较差异无统计学意义，推测CD40L持续增高可能是少数持续性ITP患儿常规治疗效果欠佳的原因之一，阻断此通路可望减少自身抗体的产生，重建免疫稳态，为持续性ITP尤其是难治性ITP患儿的治疗提供一个新思路。

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[参考文献]

[1] Rodeghiero F，Stasi R，Gernsheimer T，et al.Standardization of terminology， definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children： report from an international working group[J].Blood，2009，113：2386-2393.

[2] 盛光耀，翟慢慢.免疫性血小板减少症研究新进展[J].中国小儿血液与肿瘤杂志，2013，18（3）：97-99.

[3] Tarantino M.Recent advances in the treatment of childhood immune thrombocytopenic purpura[J].Sem in Hematol，2006，43（3 supp l5）：11-17.

[4] Kang CM，Lee JG，Kim KS，et al.Long-term follow-up of laparoscopic splenectomy in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].J Korean Med Sci，2007，22 （3）： 420-424.

[5] Zaja F，BaccaraniM，Mazza P，et al.A prospective randomized study comparing rituximab and dexamethasone vs dexamethasone alone in ITP： results of final analysis and long term follow up[J].Blood （ASH AnnualMeeting Abstracts） ， 2008， 112 （11）：1.

[6] Bussel JB，Kuter DJ，George JN，et al.AMG531，a thrombopoiesis- stimulating protein for chronic ITP[J].New Engl J Med，2006，355（16）：1672-1681.

[7] 王弘，吴琼，徐刚，等.霉酚酸酯治疗难治性特发性血小板减少性紫癜10例[J].实用儿科临床杂志，2010，25（3）：214-216.

（收稿日期：2013-12-11）endprint

鼠抗人CD40-FITC、CD40L-PE均购自eBioscience公司，流式细胞仪 FACScan，美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 CD40、CD40L的检测 采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞，取100?L单个核细胞悬液分别加入含单克隆荧光标记抗体CD40-FITC、CD40L-PE各10μL的试验管中，混匀后20～25℃避光孵育20～30min，PBS液洗涤后上机检测，用CELL Quest软件分析。

1.3.2 PAIgG的检测 采用ELISA法，PAIgG含量测定试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司。

1.4 统计学分析

采用SPSS16.0统计软件进行分析，实验数据以（）表示，样本符合正态分布，组间比较用单因素方差分析，相关分析用Pearson线性相关分析方法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD40、CD40L的表达情况

（1）与对照组比较，CD40在治疗前和治疗后的表达均增高（t=8.327，P<0.01；t=5.549，P<0.05），CD40L在治疗前和治疗后的表达均增高（t=5.098，P<0.05；t=4.264，P<0.05）；（2）CD40在治疗前表达高于治疗后（t=3.363，P<0.05），CD40L治疗前后表达差异无统计学意义（t=0.758，P>0.05）。见表1。

表1 持续性ITP患儿外周血单个核细胞CD40、CD40L的表达情况（，%）

组别 例数 CD40 CD40L

治疗前 20 9.84±2.69*# 6.38±2.36▲

治疗后 20 8.27±1.87▲ 5.85±2.73▲

对照组 20 6.45±2.08 4.37±1.94

注：与对照组相比，*P<0.01，▲P<0.05；治疗前与治疗后比较，#P<0.05

2.2 与PAIgG的相关性分析

CD40、CD40L与PAIgG呈正相关（r分别为0.713、0.746，P<0.05）。

3 讨论

2009年美国血液学协会正式将特发性血小板减少性紫癜更名为免疫性血小板减少症，新标准根据病程分为三型：新诊断的ITP（Newly ITP）：即自诊断之日起，病程在3个月之内；持续性ITP（Persistent ITP）：病程3～12个月，包括未获得自发缓解或停止治疗后不能维持完全缓解的患者；慢性ITP（ Chronic ITP）：病程持续12个月以上。80%～90%的儿童ITP患者常于6个月内获得缓解[2]。ITP的发病机制复杂，目前认为与体液及细胞免疫紊乱、病毒及幽门螺杆菌感染、巨核细胞异常等多种因素有关。CD40-CD40L为体内特异性免疫系统重要的一对共刺激分子，在机体的体液免疫和细胞免疫反应中起重要作用，在自身抗体的形成中起重要作用，参与多种自身免疫性疾病的发病过程。在血小板抗体产生过程中，CD40/CD40L相互作用提供的共刺激信号在活化淋巴细胞进而引起免疫反应的过程中是必不可少的。研究证明ITP患儿体内存在T、B淋巴细胞的异常活化。

ITP的一线治疗目前仍是以肾上腺糖皮质激素和IVIG为主，但治疗效果并不理想，复发率高，且不能影响ITP的自然病程[3]。而达那唑、环孢素A、长春新碱等药物副作用大，疗效也并不理想。对于难治性ITP，脾切除术治愈率高，但存在严重出血风险，并需长期服用激素和其他免疫抑制剂，严重影响患儿的生活质量[4]。近年来对ITP发病机制的深入研究令许多定向免疫干预措施进入临床，如应用抗RhD免疫球蛋白减少单核-巨噬细胞对血小板的吞噬；应用抗CD20单抗抑制B淋巴细胞功能，减少自身抗体的产生；应用血小板生成素（TPO）类似物促进巨核细胞增殖及发育成熟，以及IFN2α、霉酚酸酯（MMF）、造血干细胞移植等方法，均取得了一定疗效[5-7]，但在儿童中的应用报道较少。

本实验结果表明CD40、CD40L在持续性ITP患儿治疗前后外周血单个核细胞的表达明显增高，且CD40、CD40L的表达与PAIgG呈正相关，提示CD40-CD40L在PAIgG的产生中起重要作用，其表达增高促进了自身反应性B淋巴细胞激活，从而产生大量抗血小板抗体，使血小板破坏增多并生成减少。治疗后CD40明显降低，而CD40L治疗前后比较差异无统计学意义，推测CD40L持续增高可能是少数持续性ITP患儿常规治疗效果欠佳的原因之一，阻断此通路可望减少自身抗体的产生，重建免疫稳态，为持续性ITP尤其是难治性ITP患儿的治疗提供一个新思路。

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（上接第页）

[参考文献]

[1] Rodeghiero F，Stasi R，Gernsheimer T，et al.Standardization of terminology， definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children： report from an international working group[J].Blood，2009，113：2386-2393.

[2] 盛光耀，翟慢慢.免疫性血小板减少症研究新进展[J].中国小儿血液与肿瘤杂志，2013，18（3）：97-99.

[3] Tarantino M.Recent advances in the treatment of childhood immune thrombocytopenic purpura[J].Sem in Hematol，2006，43（3 supp l5）：11-17.

[4] Kang CM，Lee JG，Kim KS，et al.Long-term follow-up of laparoscopic splenectomy in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].J Korean Med Sci，2007，22 （3）： 420-424.

[5] Zaja F，BaccaraniM，Mazza P，et al.A prospective randomized study comparing rituximab and dexamethasone vs dexamethasone alone in ITP： results of final analysis and long term follow up[J].Blood （ASH AnnualMeeting Abstracts） ， 2008， 112 （11）：1.

[6] Bussel JB，Kuter DJ，George JN，et al.AMG531，a thrombopoiesis- stimulating protein for chronic ITP[J].New Engl J Med，2006，355（16）：1672-1681.

[7] 王弘，吴琼，徐刚，等.霉酚酸酯治疗难治性特发性血小板减少性紫癜10例[J].实用儿科临床杂志，2010，25（3）：214-216.

（收稿日期：2013-12-11）endprint