改良CT A B法对提取玫瑰D NA质量的影响

严廷良，许惠秋，张颖，修效中，苗启晨，李蕾*

（1.海南师范大学生命科学学院，海南海口571158；20三亚兰德种业有限公司，海南三亚572000

改良CT A B法对提取玫瑰D NA质量的影响

严廷良1，许惠秋2，张颖1，修效中1，苗启晨1，李蕾1*

（1.海南师范大学生命科学学院，海南海口571158；20三亚兰德种业有限公司，海南三亚572000

玫瑰（Rosa rugosa）组织色素较多，富含酚类物质.为了提取适于SRAP分析的高质量的玫瑰DNA，本实验基于CTAB法，在浓度2%和3%CTAB基础上，设计不同浓度的β-巯基乙醇和PVP抗氧化剂进行5种组合，研究了β-巯基乙醇和PVP对玫瑰DNA提取质量的影响.结果表明，在3%CTAB提取液中添加适量的β-巯基乙醇和PVP能获得纯度较高的玫瑰DNA，在组合III（3% CTAB、2%β-巯基乙醇+10%PVP）中，DNA电泳谱带清晰，无明显拖尾现象，SRAP分子标记效果较好，DNA的质量和纯度均满足于SRAP技术和DNA指纹图谱研究的要求.

玫瑰；DNA；β-巯基乙醇；PVP

玫瑰（Rosa rugosa）是我国传统名花，有着2000余年的栽培历史[1]，目前主要是作为园林绿化材料和食品、香料工业重要原料，我国是重要的玫瑰原产地之一，拥有非常丰富的玫瑰种质资源.但由于其分布地域较广、繁殖方式多样，使得品种间的亲缘关系模糊不清[2]，同时由于大部分玫瑰品种在形态上非常接近，或同一品种在不同地区皆有栽培，存在“同名异物”、“同物异名”现象，使玫瑰品种鉴定存在一定困难，分子生物学技术的发展已成为解决该问题的重要方法，因此，很有必要对玫瑰品种进行分子生物学研究分析.

相关扩增多态性（SRAP）是2001年由Li和 Quiros[3]开发的一种基于PCR的分子标记技术，其优点在于准确率高和稳定性较强，在反映物种形态学变异和进化历史方面提供的信息比RAPD和AFLP更丰富[4]，较适于检测物种之间亲缘关系和比较近的品种之间的差异[5]，故采用SRAP技术对玫瑰品种进行遗传多样性分析可以更好地揭示玫瑰的亲缘关系.

植物组织中含有大量多糖、多酚、酯类等次生代谢产物,要从中提取高质量的DNA比较困难，特别是玫瑰中，含有大量的玫瑰色素和较高的酚基、酚羟基等酚类化合物[6].目前多这类植物研究中使用试剂盒的提取方法比较多见，传统的CTAB方法越来越少用，李金璐等对CTAB法的改良过程中表明经过改良的CTAB法提取DNA成本远低于试剂盒法，且提取出的DNA质量较高[7].

本实验在常用CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法[8]的基础上对不同浓度的β-巯基乙醇和PVP设计5种DNA提取方案，通过比较分析，确定出最佳的适用于SRAP分子标记技术的玫瑰总DNA的提取方法，为其分子生物学研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为2012年采自三亚亚龙湾国际玫瑰谷共200个玫瑰品种，随机选取3个品种作为供试材料（A：伯尼卡（R rugosa‘Bonica），B：冰山（R rugosa‘Flceberg），C：芬德拉（R rugosa‘Vendela）），供试材料均为嫩叶.

1.2 实验方法

1.2.1 玫瑰DNA的提取

采用传统CTAB法进行改良，从新鲜玫瑰叶片中提取基因组DNA，对PVP、β-巯基乙醇和CTAB的浓度进行改良，优化提取液，每个处理，每个材料重复3次.具体改良方案和步骤如下：

提取出来的DNA用2%琼脂糖凝胶再110V电压200mA电流下进行电泳，电泳结束后，用Alpha Imager IS-2200凝胶成像系统拍照将结果，用岛津公司Uvmini-1240型紫外分光光度计检测后计算DNA溶液浓度与纯度，-20℃保存备用.聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物（参照徐大宗等）[2].

表1 五种改良的提取液方案Tab.1Five kinds of modified extract solution

1.2.2 玫瑰样品DNA进行SRAP-PCR扩增

SRAP-PCR反应体系为：引物0.9μmol/L、dNTPs 200μmol/L、Mg2+1.6mmol/L、模板DNA 15 ng，TaqDNA聚合酶1.0μL、总体积为10μL.SRAP-PCR反应程序参照徐大宗等[2]，30个循环.并用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物和银染法染色.实验所用引物碱基序列参照Li和Quiros[3].

1.2.3 指纹图谱的构建

利用软件Gel2.0识别凝胶电泳图并与标准图谱进行比对（参照徐大宗等）[2].

2 结果与分析

2.1 样品DNA的提取结果

用5种处理方法，提取3个材料，每个处理及重复称取叶片0.5g，DNA浓度及质量用核酸蛋白仪进行测定.结果见表2，A材料，每个处理下DNA质量（A260/A280）都较低（<1.8），浓度在46~300ng/μL之间.较好的是IIA（A260/A280=1.65），显著高于其他处理.B材料5个处理中，II、III和IV处理效果较好，A260/A280比值在1.6-1.88之间，浓度在125~580ng/ μL之间.C材料5个处理中，III处理效果较好，A260/ A280比值为1.89，显著高于其他处理组，浓度为109 ng/μL.结果表明，III处理方法效果比较好，可用于大量玫瑰材料的DNA提取.

表2 不同提取液对玫瑰DNA提取量及纯度的影响Tab.2Influence of different extract solution on the roses DNA extraction amount and purity

2.2 DNA样品SRAP-PCR扩增结果及多态性信息

选取提取液III提取玫瑰样品DNA进行SRAPPCR扩增，SRAP引物参照Li和Quiros[3]，凝胶电泳结果经银染后见图1.

从图1可以看出采用III处理效果方法提取的DNA用于SRAP-PCR扩增效果较好，条带清晰，多态性条带丰富，可用于SRAP分子标记.

用8对引物（Me1-Em3、Me2-Em7、Me2-Em9、Me5-Em8、Me6-Em8、Me8-Em9、Me5-Em9、Me6-

Em10）筛选184份玫瑰材料，结果表明所检测的玫瑰品种间存在较丰富的遗传多样性和复杂的遗传背景，引物组合Me2-Em7扩增出的的多态性位点最多，多态位点百分率最高.三对引物组合（Me1-Em3、Me2-Em7、Me2-Em9）扩增效果都较好（见表3），可用于对玫瑰品种遗传多样性分析.

图1 SRAP分子标记图，引物Me1-Em3扩增部分结果Fig.1Molecular marker map of SRAP and the amplification result of some Me1-Em3

表3 不SRAP引物扩增结果及多态性信息Tab.3Results and the polymorphism information of SRAP primers

2.3 玫瑰品种指纹图谱的构建

根据筛选出的3对引物组合：Me1-Em3、Me2-Em7、Me2-Em9.利用软件Gel2.0对扩增的凝胶电泳图进行识别处理，总共建立了184个玫瑰品种的标准DNA指纹图谱（部分品种标准指纹图谱见图2）.本实验结果经鉴定表明，当相似度为95%时，该指纹图谱的鉴别准确率达100%，准确率较高，故筛选出的3对引物组合可用于玫瑰品种的鉴定.

3 结果与讨论

图2 部分品种标准DNA指纹图谱参照（50 bp Marker）Fig.2The standard DNA fingerprint of some cultivars（50 bp Marker）

玫瑰中含有较高的色素，玫瑰色素的主要成分是山茶黄素和榭皮黄素类化合物R[9]，还含有较高的酚基、酚羟基等酚类化合物[10]，导致所提的DNA中的色素和酚类物质含量较高，不符合外源DNA导入和DNA分析的纯度要求.目前对植物DNA提取中酚类物质的去除，一般都是在提取液中加入适量的抗氧化剂和螯合物，防止多酚氧化褐变用的较多是试剂是β-巯基乙醇和PVP，其中β-巯基乙醇是作为一种强还原剂来保护DNA免受醌类物质、二硫化物、多酚氧化酶等物质的损害，防止酚氧化；PVP是一种酚的络合物，可与酚类物质结合，有效地抑制酚类物质的氧化，从而减少酚类物质的含量，起到纯化样品的作用[11].本实验中发现没有加PVP的样品中，在用冷无水乙醇沉淀时，得到的DNA不是透明丝状，而是像胶水呈粘稠状，多糖将DNA绕裹在一起，而加入10%的PVP后.所以CTAB和PVP在DNA提取过程中对富含多酚、色素的植物DNA提取过程中均有明显的纯化效果.本试验中对提取液采用不同浓度的β-巯基乙醇与PVP组合，进行多次重复试验，从提取DNA的纯度、浓度结果表明在III种提取液组合中（3%CTAB+2%β-巯基乙醇+10%PVP）提取玫瑰DNA效果较好.经SRAP-PCR分子标记效果图结果显示，试验的玫瑰品种SRAP标记都显示出清晰丰富多态性条带，可用于SRAP分子标记，筛选出适合SRAP分析用的高质量玫瑰基因组DNA提取的有效方法，通过这个改良方法提取的玫瑰DNA可较好地应用于遗传多样性分析和品种指纹图谱的构建，为进一步开展玫瑰的分子生物学研究奠定基础.

[1]李玉舒,张启翔.玫瑰基因组AFLP反应体系的建立和优化[J].北京农业职业学院学报,2008,23(5):28-33.

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[6]葛芹.食用玫瑰色素的提取、纯化及性质研究[D].无锡:江南大学,2013.

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[10]曹少谦,王可兴,潘思轶.玫瑰花瓣红色素提取及定性[J].食品科学,2007,28(3):82-84.

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责任编辑：黄澜

Effect of the Modified CTAB Method on DNA Quantity From

YAN Tingliang1，XU Huiqiu2，ZHANG Ying1，XIU Xiaozhong1，MIAO Qichen1，LI Lei1*
（1.College of Life Science，Hainan Normal University，Haikou 571158，China；2.Sanya Land Seed Limited Corporation，Hainan，Sanya 572000，China；）

Rosa rugosa is the plant with high phenolic substance and pigment.In order to extract the high quality DNA suitable for SRAP analysis,the modified method was used with 5 kinds of combinations of different concentration of β-mer⁃captoethanol and PVP and 2%or 3%CTAB.The results showed that it can get the high purity rose DNA from the extracts of the combination of 3%CTAB+2%β-mercaptoethanol+10%PVP.Furthermore,the electrophoresis bands of DNA were clear and exhibited no significant tailing phenomenon.The average yield of rose DNA can meet the quality and purity in SRAP technical and DNA fingerprint requirements.

Rosa rugosa；DNA；β-mercaptoethanol；PVP

Q 781

A

1674-4942（2014）04-0412-04

2014-08-19

三亚市专项科研试制项目（2012KS09）；大学生国家级创业训练项目（201311658034）

*通讯作者