西瓜翠衣抑制酪氨酸酶、抗自由基作用及其成分的含量测定

王园园，龙娴，钟大妹，葛月宾，汪振雄

（中南民族大学药学院，湖北武汉430074）

西瓜翠衣抑制酪氨酸酶、抗自由基作用及其成分的含量测定

王园园，龙娴，钟大妹，葛月宾*，汪振雄

（中南民族大学药学院，湖北武汉430074）

评价西瓜翠衣的抑制酪氨酸酶和抗自由基作用，并测定其成分的含量。采用酪氨酸酶活性抑制率和DPPH自由基清除率活性测定方法，分析西瓜翠衣提取物的多糖、总氨基酸和VC含量。西瓜翠衣用95%乙醇作为溶剂，提取物活性较高，其多糖、总氨基酸和VC含量分别为50.10、2.59、26.75 mg/g；提取物经大孔树脂纯化后，水洗脱部位的活性较好且富集量最大；进一步透析水洗脱部位，其透析液的酪氨酸酶活性抑制率达到58.12%，与0.25 mmol/L曲酸作用相当，DPPH自由基清除率达到56.82%。通过此研究确定了西瓜翠衣的抑制酪氨酸酶和抗自由基功效及其成分的含量。

西瓜翠衣；酪氨酸酶抑制率；DPPH自由基清除率；含量测定

西瓜翠衣，即西瓜皮，为葫芦科植物西瓜（Citrullus lanatus）的果皮，又叫西瓜青、西瓜翠等。西瓜翠衣中除含有果胶（约2%）外，还含丰富的营养成分，如多种氨基酸、微量元素、糖类以及丰富的维生素等。中医认为，西瓜翠衣性寒，味甘，有清热解暑、除烦止渴及利尿作用，可以治疗多种热盛津伤的疾病，古人称其为“天然白虎汤”[1-2]。

近年来，植物萃取物被广泛应用于食物疗养、保健品、护肤品中，其天然温和、刺激性小、效果显著等优点越来越受到人们的关注。在日常生活中，西瓜翠衣也常作为自制食品和护肤品，可以促进人体新陈代谢、消暑除烦、美白滋润皮肤、增加面部皮肤光泽、淡化痘印等[3-5]。目前，对于西瓜翠衣已有的文献报道主要包括果胶的提取、饮料的制作等食品行业、栽培技术等农业领域[6-8]，而其抑制酪氨酸酶和抗自由基等活性作用及其成分含量测定的实验研究尚未见报道。因此，本文旨在采取酪氨酸酶抑制和自由基清除两种活性测定技术，追踪开展西瓜翠衣的提取纯化工作，测定其成分的含量，为西瓜翠衣的应用开发提供研究依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

西瓜翠衣（市面所售西瓜，用刀将表皮青色含有蜡质的青色皮和红色肉质除去后所得的果皮部分）；HP20型大孔树脂：日本三菱化学公司；35kM透析袋：上海源叶生物技术有限公司；蘑菇酪氨酸酶：Worthington Biochemical Co.；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：Fluka；左旋多巴（L-DOPA）、曲酸Aladdin：上海晶纯生化科技股份有限公司；VC：国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

CP214电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；SB-800D型超声波振荡仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800PC紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司。

2 方法

2.1 西瓜翠衣样品的制备

新鲜西瓜翠衣切制成片，称取重量，按1∶5比例（质量体积比）加入提取溶剂；用组织捣碎机搅拌2 min，捣碎成匀浆状；取匀浆液进行超声萃取（500 W）30 min，过滤，滤渣再次加入同上比例溶剂进行超声、过滤，反复操作3次；合并滤液，对滤液进行减压浓缩干燥，即得西瓜翠衣提取物，4℃保存备用。

HP20大孔树脂经预处理后，西瓜翠衣提取物经少量乙醇溶解，拌样上柱，用乙醇-水进行不同浓度梯度洗脱，洗脱梯度为超纯水、10%、30%、50%、70%、90%乙醇，分段收集洗脱液，减压蒸发除去溶剂，得到膏状浓缩液，4℃保存备用。取超纯水洗脱浓缩液置于透析袋中，纯水透析。提取纯化流程见图1所示。

2.2 酪氨酸酶活性的测定

采用多巴氧化法测定样品对酪氨酸酶活性的影响作用[9-11]。反应体系见表1。

取西瓜翠衣样品用1/15 mol/L PBS（pH6.8）溶解稀释液（相当于新鲜西瓜翠衣原材料2 g/mL）1 mL，加入酪氨酸酶溶液（50 U/mL）1 mL混合均匀，32℃孵育10 min，加入0.15%L-DOPA1 mL，32℃继续孵育10 min，立即于分光光度计475 nm处测定吸光度值A。阳性对照为0.25 mmol/L曲酸溶液。西瓜翠衣提取物的对酪氨酸酶活性的抑制率（I）计算公式如下：I=[1-（C-D）/（AB）]×100%。

图1 西瓜翠衣提取纯化的流程图Fig.1 The extracting and purifying process of watermelon peel

表1 酪氨酸酶活性测定的反应液组成Table 1 The measuring system of tyrosinase activity

2.3 DPPH自由基清除率的测定

DPPH自由基清除率的测定[12]反应体系见表2。

表2 DPPH自由基清除率测定的反应液组成Table 2 The measuring system of DPPH radical scavenging rate

取西瓜翠衣样品用甲醇溶解稀释液（相当于新鲜西瓜翠衣原材料2 g/mL）0.8 mL，加入32 μg/mL DPPH溶液3.2 mL混合均匀，置于暗处静置30min，立即于分光光度计517 nm处测定吸光度值A。阳性对照为维生素C溶液。西瓜翠衣提取物的DPPH自由基清除率（Y）的计算公式如下：Y=[1-B/A]×100%。

2.4 硫酸-苯酚法测定多糖的含量[13]

精密量取待测液2 mL于试管中，加入4%重蒸苯酚1 mL，摇匀，缓慢加入浓硫酸5 mL，40℃水浴加热15 min，冰水浴5 min，于490 nm测定吸光度A值，重复测定3份样品，计算平均含量。取葡萄糖对照品溶液（1 mg/mL）稀释成不同浓度，同法测定吸光度A值，绘制标准曲线。

2.5 茚三酮比色法测定总氨基酸的含量[14]

精密量取待测液2 mL于50 mL量瓶中，加入2%茚三酮1 mL和磷酸盐缓冲液（pH=6.8）2 mL，摇匀，90℃下水浴加热15 min，冷却至室温，用蒸馏水定容，于570 nm下测定吸光度A值，重复测定3份样品，计算平均含量。取亮氨酸对照品溶液（0.1 mg/mL）稀释成不同浓度，同法测定吸光度A值，绘制标准曲线。

2.6 紫外分光光度法测定VC的含量[15]

精密量取待测液2 mL于50 mL量瓶中，加入5× 10-3mol/L氯化铜溶液3 mL，加入少量蒸馏水，在70℃下水浴加热5 min，用蒸馏水定容，冷却至室温，于246 nm下测定吸光度A值，重复测定3份样品，计算平均含量。取VC对照品溶液（400 μg/mL）稀释成不同浓度，同法测定吸光度A值，绘制标准曲线。

3 结果

3.1 不同提取溶剂对西瓜翠衣活性的影响

考察不同溶剂水、70%乙醇和95%乙醇提取西瓜翠衣，经减压浓缩干燥后对活性的影响。结果见表3。

表3 不同提取溶剂对西瓜翠衣活性的影响Table 3 Measurement of activities in watermelon peel extracts by different solvents

结果表明，相比于水和70%乙醇，95%乙醇提取西瓜翠衣的酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率活性最高。

3.2 大孔树脂纯化对西瓜翠衣活性的影响

为了进一步纯化富集西瓜翠衣的活性成分，采用大孔树脂对西瓜翠衣95%醇提物进行不同浓度的乙醇-水（0、10%、30%、50%、70%、90%乙醇）梯度洗脱，测定其活性，结果见表4。

结果表明，在酪氨酸酶抑制率活性方面，70%和90%乙醇洗脱物最高，纯水洗脱物次之；在DPPH自由基清除率活性方面，10%乙醇洗脱物最高，纯水和70%乙醇洗脱物次之。此外，通过不同浓度梯度乙醇洗脱，纯水洗脱部位收得的固形物量最大，结合活性和洗脱物质量结果，选择纯水洗脱物继续下一步的透析纯化过程。

表4 大孔树脂梯度洗脱西瓜翠衣纯化物的活性测定Table 4 Measurement of activities in watermelon peel extracts by macroporous resin purification

3.3 透析纯化对西瓜翠衣活性的影响

根据3.2实验结果，发现西瓜翠衣95%醇提物经大孔树脂纯水洗脱后，具有较好的抑制酪氨酸酶和DPPH自由基清除活性，并且该洗脱部位获得的量最大。在浓缩过程中，水洗脱物呈现一定的粘性，因此采用透析法，对该部位洗脱物进一步纯化，对透析袋外液浓缩物进行活性测定，结果见表5。

表5 透析纯化西瓜翠衣提取物的活性测定Table 5 Measurement of activities in watermelon peel extracts by dialysis

结果表明，水洗脱物经透析后，DPPH自由基清除率活性有明显提高，而对酪氨酸酶活性抑制率的影响不大。

3.4 西瓜翠衣提取物成分的含量测定

在测定样品前，绘制了葡萄糖、亮氨酸和VC的标准曲线分别为C=13.500A+0.116 3（r=0.999 5），C= 135.77A+0.026 6（r=0.999 5）和C=0.002 0A+0.015（r= 0.999 7）。对西瓜翠衣95%乙醇提取物、大孔树脂洗脱物、透析纯化物进行成分的含量测定，结果见表6。

表6 西瓜翠衣提取物成分的含量测定Table 6 Determination of contents in watermelon peel extracts

结果表明，纯水洗脱物的三类成分含量均高于10%乙醇洗脱部位；透析对多糖成分起到一定的纯化富集作用。

4 讨论

通过测定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，考察了3种提取溶剂、大孔树脂和透析分离纯化对西瓜翠衣提取物活性的影响。实验结果发现，西瓜翠衣经95%乙醇超声波萃取后，酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率均高于其它溶剂。采用大孔树脂纯化，发现不同浓度乙醇-水梯度洗脱物的酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率活性发生了变化，表明大孔树脂对西瓜翠衣提取物的活性部位进行了较好的纯化，本文对获得的量最大并具有较好活性的纯水洗脱部位开展了透析，进一步纯化富集了活性成分。

通过本次实验，测定了西瓜翠衣的酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率活性，其美白抗衰老的作用得到确定，并且测定了其成分多糖、氨基酸和VC的含量，为西瓜翠衣在食品、保健品、日用产品等的应用提供了研究依据。在此结果上，将继续开展西瓜翠衣提取纯化的工艺条件优化和质量标准研究，为西瓜翠衣的产品开发提供技术支持和质量保证。

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Anti-tyrosinase and Antioxidation Activities and Contents Determining from Watermelon Peel

WANG Yuan-yuan，LONG Xian，ZHONG Da-mei，GE Yue-bin*，WANG Zhen-xiong
（College of Pharmacy，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，Hubei，China）

To determine the contents and evaluate the anti-tyrosinase and antioxidation activities of extract from watermelon peel.Watermelon peel was extracted by different extraction solvents，macroporous resin purification as well as dialysis bag.And the contents of polysaccharides，amino acids，vitamine C were measured.In order to evaluate and compare the anti-tyrosinase and antioxidation activities of watermelon peel extracts，the tyrosinase activity inhibition rate and DPPH free radical scavenging rate were measured in vitro.It showed that selecting 95%ethanol as the extraction solvent，the anti-tyrosinase and anti-oxidative actions of extract were better than othersolvents，inwhichthecontentsofpolysaccharides，aminoacids，vitamineCwere50.10，2.59and26.75mg/g，respectively.After purification by macroporous resin，water-eluting location obtained much amount and showed higher activities.The elution was further dialyzed and the tyrosinase activity inhibition rate and DPPH free radical scavenging rate of the concentrate in the outside of dialysis bag were 58.12%and56.82%，respectively. Through the process，the anti-tyrosinase and antioxidation activities of watermelon peel was clear and the contents of active ingredients were determined.

watermelon peel；tyrosinase activity inhibiting rate；DPPH radical scavenging rate；contents determining

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.018

2014-07-10

国家级大学生创新训练计划（GCX13108）;中南民族大学十二五“民族药学”国家级实验教学示范中心和中南民族大学药物制剂品牌专业项目资助

王园园（1990—），女（汉），本科，研究方向：活性产物。*通信作者：葛月宾，副教授，硕士生导师，博士。