被冰水浸泡后大鼠断肢再植的实验研究

周健辉，李秀文，王夫平，冷树立

(南方医科大学附属小榄医院手外科，广东中山 528415)

·论著·

被冰水浸泡后大鼠断肢再植的实验研究

周健辉，李秀文，王夫平，冷树立

(南方医科大学附属小榄医院手外科，广东中山 528415)

目的研究被冰水浸泡大腿断肢后的不同时段对血管损伤程度的影响，为被冰水浸泡的断指再植病例提供科学理论支持。方法实验选用成年大鼠共20只，雌雄不限，随机分为4组，分别把左侧大腿中上1/3水平环形离断，然后分别将断肢冰水浸泡1 h、2 h、4 h、6 h。然后对每组断肢血管进行病理观察，再将不同组织别断肢进行再植，术中观察血管通血情况，通血0.5 h后均将血管切断，再次对断肢血管行病理分析，最后再次接通断肢血运，缝合皮肤，把小鼠送回试验室，观察各组断肢再植的成活率。结果血管内皮细胞在冻伤后的1 h、2 h、4 h内未见明显损伤，但在通过恢复血流复温后，内皮细胞就会产生不同程度的损伤。在1 h组及2 h组中，断指再植的成活率较高，在4 h组断肢再植成活率低，在6 h组中，无一断肢成活。结论被冰水浸泡后的血管损伤程度随着时间的推移而加重，浸泡的时间越长，复位后血管形成的血栓越容易，当到达6 h以上均形成不可逆性损伤。

冰水浸泡；断肢；再植；血管损伤

被冰水浸泡后的断腕、断指再植成功案例在国内已经屡有报道，在本地区也遇到不少，但成活率较正常保存的低，有学者曾经用大鼠来研究断肢不同保存方法对血管的损伤情况，但还没有研究冰水浸泡时间长短对断指血管的损伤以及断肢再植成活率的影响。本实验研究大鼠组织离体后，通过冰水浸泡保存肢体的不同时段的病理学研究，探讨冰水浸泡后的不同时段对血管的损伤程度，为临床医生在接诊有关冰水保存断肢患者时提供手术适应证、手术操作、术后护理的参考及相关的理论支持。

1 资料与方法

1.1 动物分组及模型的建立选用成年大鼠共20只，雌雄不限，将20只大鼠分为术后离断肢体被冰水浸泡1 h组、2 h组、4 h组、6 h组，每组大鼠5只，左侧大腿为手术实验侧。

1.2 实验过程及记录相关数据的办法

1.2.1 大鼠的麻醉及注意事项首次麻醉以0.3 ml/100 g的剂量行腹腔注射10%的水合氯醛，实验手术中根据大鼠麻醉的状态，腹腔再注射1/3的量来维持麻醉，避免大鼠产生任何自发运动，影响手术的操作，直至手术结束。

1.2.2 大鼠左侧肢体的离断固定、消毒、铺巾，将左侧大腿中上1/3水平作半环形切口，分离出股动静脉，然后将股动静脉离断并结扎断端，然后将皮肤、肌腱、神经、骨质离断，环形离断皮肤，然后分别将离断肢体用冰水浸泡1 h、2 h、4 h、6 h。

1.2.3 观察冰水浸泡后及复温后的血管变化将每一组血在冰水浸泡所需的时间后，切取少段动脉组织，制作成病理切片，并记录镜下的情况。然后将大鼠断肢的动脉与近端吻合，经复温10 min后，取下少段动脉组织，再次制作成病理切片观察。

1.2.4 观察各组再植肢体的成活率将各组断肢吻合动静脉后，缝合皮肤，然后用夹板固定双下肢，麻醉苏醒后放回笼子，放置食物和水，观察再植肢体的成活率。

2 结果

分别对各个实验组大鼠血管的复温前后取样，制作成标本后在电子显微镜下观察血管损伤的变化，以血管舒张、红细胞渗出、血栓形成、内皮细胞破裂、内皮下层损伤、中膜弹性纤维损伤为阐述血管损伤程度的指标，做好相应的记录和对比。结果显示，复温前后血管损伤程度随着时间的推移而加重。分别将各试验组的断肢进行再植，结果显示，随着浸泡时间的推移，断肢成活率明显降低，见表1。

表1 各个实验组大鼠离断肢体在不同时段冰水浸泡后血管损伤情况及再植成活率

3 讨论

由实验结果证明，被冰水浸泡的肢体对血管是有损伤的，在不同时间的复温也均有不同的损伤程度。在冻伤时由于冻-融过程的物理因素及一系列生化改变导致冻伤组织循环及血管内皮细胞损伤已被证实[1]。国内卢学春等[2]通过对冻伤大鼠内皮细胞国内改变的研究表明，在血管冻伤后ACE活性增高、人抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)含量及活性降低，这些指标改变与冻伤的程度有密切关系，表明冻伤后血管内皮细胞有不同程度的损伤。由于血管内皮细胞这些改变，使血液凝固性增强，血管收缩而促进冻伤组织血液循环及代谢障碍，进而导致冻伤组织坏死。就内皮细胞而言，本实验中发现血管内皮细胞在冻伤后的1 h、2 h、4 h内未见明显损伤，但在通过恢复血流复温后，内皮细胞就会产生不同程度的损伤，这就说明由于冻-融这个过程会因为各种化学物质的大量释放后，导致细胞的破裂死亡。这个机理目前也有报道是胞浆中的PGI2释放到血液中所致[3]。所以为减少复温后冻伤血管对内皮细胞的损伤程度，可能可通过抑制PGI2实现，但有关这方面的论据还需要进一步的论证。

实验表明，随着时间的推移，血管纤维层的损伤也进一步的加强，随着肌纤维的变性，横纹消失，大片坏死，血管壁部分坏死，部分弹性纤维的断裂，有较多纤维素性和混合性血栓形成。在浸泡后4 h开始出现血管的扩张，经血液复温后，情况加重，血管失去弹性张力，不利于血流的输送。

在1 h组及2 h组中，断指再植的成活率较高，这与断肢浸泡时间比较短有关，经复温后，血管损伤程度较轻，组织能自行修复，未出现组织不可逆性损伤。我们认为，在此类断指(肢)再植中，成活率较高，应该尽一切努力进行再植，术后常规治疗会得到较好的效果。

在4 h组断肢再植成活率低，我们认为，随着时间的推移，血管损伤的程度加重，大部分已出现不可逆性损伤。即使在手术中显微镜下观察血管内壁的大致形体无太大的变化，但在接通血管复位后，血管的缺血再灌注损伤明显，乃至发生了血管逆损伤，血管出现明显扩张、内膜细胞的破裂导致血栓的广泛形成。此类断肢再植成活率不高，或者有必要进一步解决再灌注损伤的难题，更有利于断肢再植的成活。

在6 h组中，可见无一断肢成活，可见此时段的血管损伤最重，甚至在复温前已出现明显的血管损伤现象，经接通血管复温后，由于灌注的进一步损伤，另血管结构彻底的破坏，导致血管栓塞，肢体坏死。

目前在血管冻伤微循环变化方面有很多研究[4-9]，但由于各家的方法、条件及动物的模型不同，导致实验结果缺乏可比性，甚至相互矛盾。事实证明冻伤微循环的研究已不限于微血管结构、功能状态的改变以及血流状态的改变，同时与血管内皮细胞、血细胞的功能及二者之间的相互作用。通过以上实验组的结果，只能重某方面阐明局部冰水直接冻伤血管内皮细胞产生的后果，可以得出该种模式下的血管冻伤与时间段的关系。对于整体的血管冻伤微循环变化还有待于进一步的研究。

[1]Bourne MH,Piepkorn MW,Clayton F,et al.Analysis of micro vas-cular change in frostbite injury[J].J Surg Res,1986,40(1):26.

[2]卢学春,李凤芝,迟小华,等.免疫复合物参与冻伤大鼠冻结-融化损伤的研究[J].中国应用生理学杂志,2006,22(4):645-646.

[3]孔炜,方华丰,王迪浔,等.急性缺氧对肺动脉内皮细胞血栓素合酶基因表达及PGI2、TXA2代谢产物的影响[J].同济医科大学学报,2001,30(4):295-297.

[4]杨增仁,杜桂仙.冻伤微循环研究概况[J].循环医学杂志,l996,6 (4):43-45.

[5]李凤芝,颜培华、刘友梅,等.冻伤大鼠血管内皮细胞功能改变的研究[J].中华创伤杂志,1994,10(6):280-281.

[6]张中兴,辛素贤,彭长营.重度冻伤试验模型的研究[J].中华医学杂志,1980,60(11):673-675.

[7]阎红,赖西南,葛衡江,等.两种复合战伤合并海水浸泡对血管内皮损伤的比较研究[J].中华航海医学与高气压医学杂志,2010, 31(4):521-522.

[8]苗卫东,曹湘豫,张韶民,等.桡动脉腕背支为蒂的手背逆行岛状筋膜皮瓣的临床应用[J].局解手术学杂志,2004,13(2):83-84.

[9]姜忠华,王少春,王全平,等.低温海水淹溺大鼠血气与额叶皮层前列腺术和降钙素基因相关肽的变化[J].中华劳动卫生职业病杂志,2003,21(5):381-382.

Experimental study of rat limb replantation of ice water immersion.

ZHOU Jian-hui,LI Xiu-wen,WANG Fu-ping,LENG Shu-li.Department of Hand Surgery,Xiaolan People's Hospital Affiliated to Southern Medical University, Zhongshan 528415,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the effect of different periods of ice water immersion on the vessel injury degree,and to provide scientific theoretical support for rat limb replantation of ice water immersion.MethodsTwenty adult rats,regardless of gender,were selected and randomly divided into four groups,which were soaked in ice water for 1 hour,2 hours,4 hours,6 hours after the left leg in 1/3 horizontal ring off,respectively.Then pathological analysis was performed on each limb vessel,then the limb was replanted.The blood flow was observed,and the vessel was cut off again after half an hour.Based on pathological analysis,the limb blood circulation was restored and the skin was sutured.Then the rats were sent back to laboratory to observe the survival rate of limb replantation.ResultsVascular endothelial cells were found no obvious damage after 1 h,2 h,4 h of ice water immersion,but showed different degrees of damage after rewarming by the restoration of blood flow.The survival rate of replantation was relatively higher in 1 h group and 2 h group,lower in 4 h group,with no limb survival in 6 h group.ConclusionThe vascular inju-ry degree increases with the time of ice water immersion.The longer the immersion time,the easier the formation of blood vessels after reset thrombosis,The damage is irreversible after 6 hours ice water immersion.

Ice water immersion;Severed limb;Replantation;Blood vesse Injury

R-332

A

1003—6350（2014）03—0317—03

2013-05-29)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.03.0124

周健辉。E-mail：zjhlxw@163.com