急性白血病患者HPA-1～6，15基因多态性与血小板输注疗效的相关性研究

苗菁，曾小菁

（贵阳医学院附属医院血液科，贵州贵阳 550004）

·论著·

急性白血病患者HPA-1～6，15基因多态性与血小板输注疗效的相关性研究

苗菁，曾小菁

（贵阳医学院附属医院血液科，贵州贵阳 550004）

目的通过检测人类血小板抗原1～6,15系统(Human platelet alloantigen，HPA-1～6,15)，探讨HPA多态性与血小板输注疗效的相关性。方法(1)收集30例输注2次以上血小板的急性白血病患者外周血标本，根据血小板回收率（Percentage platelet recovery，PPR)判定输注效果；(2)采用酚/氯仿方法提取DNA；(3)采用聚合酶链反应-序列特异性引物（Polymerase chain reaction-sequence specific primers，PCR-SSP）方法在相同条件下对血小板抗原HPA-1～6,15进行基因分型，分析HPA抗原与血小板输注疗效的关系。结果(1)HPA-1～3、HPA-5～6、HPA-15系统等位基因呈多态性分布；HPA-4呈aa纯合子单态性分布，HPA-1、5、6基因以aa纯合子为主，仅HPA-3、15见bb纯合子，b等位基因频率以HPA-2最高(0.65)，其次依次为HPA-15(0.349)，HPA-3(0.3)。(2)30例急性白血病患者中有21例血小板输注无效，无效率为70%，多集中于输注3次及以上组。结论(1)抗-HPA引起血小板输注无效概率较小，主要发生在HPA-2、3、15系统，对需作HPA配型的患者只要针对此3个系统进行检测，就可提高输注效果。(2)临床应注重血小板输注治疗的个体化，减少输注次数，提高输注疗效。

血小板输注；疗效；急性白血病；血小板特异抗原；基因多态性

随着输血医学的不断发展，成分输血的推广使用，血小板输注已成为临床输血治疗疾病的重要手段之一。但部分患者在输注血小板后出血症状仍无改善，血小板计数水平仍旧很低。而只要2次及2次以上给予足量血小板，血小板增值未达预期值，即可定义为血小板输注无效(Platelet transfusion refractoriness，PTR)[1]。近年来随着血小板输注的日益增加，PTR成为制约临床治疗的一大难题。在临床血小板输注过程中，如果血小板同种抗原不合．可导致机体产生血小板同种抗体，引起PTR。人类血小板抗原系统(Human platelet alloantigen，HPA)为血小板特有，具有独特的遗传多态性，可介导同种免疫性抗体的产生。为了研究血小板基因遗传多态性在血小板输注疗效的影响，我们应用聚合酶链反应一序列特异性引物(Polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)技术，选取急性白血病患者，对HPA1-6, 15系统在同一扩增条件下进行同步扩增，用病例间比较的方法，探讨HPA1-6,15基因多态性与血小板输注疗效的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料考虑到急性白血病为临床接受血小板输注最多的人群，故选取30例急性白血病患者为研究对象，均为2012年6～10月在贵阳医学院附属医院血液科住院患者。其中急性淋巴细胞白血病4例，急性髓细胞白血病26例，均符合各型急性白血病诊断标准[2]，男性17例，女性13例，年龄12～63岁，平均(43±7.31)岁。

1.2 血小板悬液输注所用血小板悬液均由贵州省血液中心提供。制剂悬液均达到国家质量标准。机采1个治疗量单采血小板为200～250 ml，含血小板数≥2.5×1011；手工制备血小板1 U由200 ml全血分离25～30 ml，含血小板数2.5×1010，输入10 U相当于机采血小板1个治疗量[1]。

1.3 血小板输注指征及用法血小板输注指征：入选患者化疗后血小板＜10×109/L或≥10×109/L但伴感染发热或有出血倾向时输注血小板[3]，每次输注浓缩血小板10 U或单采血小板一个治疗量。

1.4 血小板输注效果评价血小板输注效果评价用血小板回收率PPR(Percentage platelet recovery)来评价，输注后24 h PPR＞20%即判断为输注血小板有效[1]。

1.5 主要仪器和试剂梯度PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)，PE9700扩增仪(美国ABI公司)，Taq聚合酶(大连宝生物工程有限公司)；PCR引物序列设计参见文献[4]，每一个HPA系统设计三条引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成提供。

1.6 统计学方法采用SPSS13.0软件包进行统计学分析。根据电泳条带确定每个标本的基因型，等位基因频率用直接采用基因计数法，计算HPA-1～6,15系统的各基因型、基因频率，并进行Hardy-Weinberg平衡检验，组间比较用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPA基因分型扩增产物鉴定内对照带引物为人类生长激素，均为429 bp，电泳结果显示每孔均可见清晰的内对照带，阴性孔中无特异性扩增带，表明无相应的基因。阳性孔中除外内对照带可见清晰、特异的扩增带(片段大小参照表中目的条带的碱基数)，表示有相应的基因。结果见图1和图2。

图1 一例样本的HPA 1-6,15分型

图2 HPA 2、3、15图例

2.2 输注血小板次数与输注效果的比较按输注次数分为＜3次及≥3次组，计算24 h PPR后结果：30例中仅9例达到输注有效标准，总有效率为30%，且大多集中于输注＜3次组。证明血小板输注次数与输注效果有关，血小板输注有效率随输注次数增加而下降。

2.3 30例样本HPA-1～6,15等位基因分布比较结果显示，可见仅HPA-4均表现aa纯合子，呈单态性表现，其余均表现有多态性；HPA-1、5、6以aa纯合子基因型为主；b等位基因频率以HPA-2最高(0.65)，其次依次为HPA-15(0.349)，HPA-3(0.3)，见表1。

表1 HPA-1～6,15等位基因分布比较

2.4 输注有效组与无效组HPA-1～6,15等位基因频率Hardy-Weinberg平衡检验本实验除无效组中HPA-2基因频率(P＜0.05)不符合Hardy-Weinberg平衡定律外，其他系统实际基因频率与理论基因频率分布差异均无统计学意义(P＞0.05)，均符合Hardy-Weinberg平衡定律，见表2。

2.5 血小板输注有效组和无效组的HPA-1～6, 15基因型和基因频率比较血小板输注有效组和无效组基因型频率、基因频率之间的差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

注：aP＜0.05，即不符合Hardy-Weinberg平衡定律。NA，无效。

表3 血小板输注有效组、无效组的HPA-1～6,15基因型和基因频率的比较

3 讨论

临床上，血小板输注对预防和治疗血小板减少或功能缺陷患者的出血是一种有效治疗方法。由于血小板来源少，保存困难，费用高，输注过多不仅增加患者的经济负担，浪费血源，还可能引起与血小板输注相关的不良反应而导致PTR。有研究认为反复多次的血小板输注可使HLA和HPA类抗原刺激患者机体产生同种免疫反应，导致外源性血小板破坏，且输注次数越多，检出血小板抗体的阳性率就越高，这是引起血小板输注无效的重要原因[5]。本研究结果显示输注3次及以上血小板输注无效率明显上升，血小板输注无效率达70%，与文献报道血小板输注无效率30%～70%[6]相符。

根据一份综合调查报告表明，尽管输注血小板无效涉及因素甚多，但认为与血小板抗体密切相关[7]。国外血小板抗体高发频率调查结果显示，同种人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)抗体的频率最高，其次是HPA抗体。选择HLA配合的血小板，或HLA以及HPA都配合的血小板，是一个减少血小板输注无效的方法之一[8-9]。发生HPA免疫机会的多少与人群中HPA抗原分布频率有关，HPA系统中对偶抗原不配合的比例越高，产生HPA抗体的机会越多，产生PTR的可能性越大。国外文献报道白种人易引起PTR的血小板特异性抗原有HPA-1a、HPA-lb、HPA-2b、HPA-3a、HP-3b、HPA-4a、HPA-5b等[10]；我国青岛、上海、南京、石家庄和成都等地血液中心已开展血小板抗原基因分型检测，通过血小板抗原基因多态性分析，发现各地HPA多态性分布均表现有一定的地域性差异，但以HPA-15a/b、HPA-3a/b、HPA-2a/b、HPA-5a/b、HPA-4a/b的不配合率较高，此外国内研究曾经在PTR患者中检出HPA-2b抗体[11]。本实验结果显示，实验组HPA-4呈aa纯合子单态性分布，HPA-1～3、5～6、15等位基因频率均呈多态性分布，以HPA-2杂合度最高；HPA-1、5、6以aa纯合子基因型为主，仅HPA-3、15见bb纯合子；b等位基因频率以HPA-2最高(0.65)，其次依次为HPA-15(0.349)，HPA-3(0.3)，与文献报道中国大部分地区汉族人群b等位基因频率表达前三位依次为HPA-15、HPA-2、HPA-3的抗原系统一致，但顺序略有不同[12-13]。由此可推论：HPA-15、HPA-2、HPA-3系统有高度多态性，较易发生由基因不相合引起的免疫反应，是HPA多态性导致PTR的主要影响抗原系统。

董伟群等[14]对PTR的免疫性因素的相关研究提示：免疫因素所致PTR中90%是由抗-HLA引起，黄种人产生抗-HPA仅占10%左右。李志强等[15]曾对49名反复输血的恶性血液病患者进行抗-HLA与抗-HPA筛查试验报道，多数患者相继出现抗-HLA，而始终未检出抗-HPA，故认为抗-HPA非血小板输注无效的主要原因。而本实验数据显示，血小板输注有效组和无效组之间HPA-1～6,15系统基因型和基因频率的差异未发现有统计学意义(P＞0.05)，也证实抗-HPA在导致PTR各因素中所占比例不大，可不考虑其为导致PTR的主要原因，扩大样本例数还可进一步论证。

本实验结果见输注无效组HPA-2基因频率不符合Hardy-Weinberg平衡法则。根据既往文献理论：Hardy-Weinberg平衡本质上是一种理想状态，其假设条件在一般人群中很难得到满足，因此Hardy-Weinberg平衡是相对的，主要针对正常无疾病人群，因为疾病本身就是一种选择限制，不属于随机选择，不平衡是正常的[16-17]。本实验样本均选自急性白血病患者，进行的是病例间疗效比较，所以出现不平衡仍可进行结果分析。

综上所述，在未来的临床工作中，输注血小板应防范多因素所致输注无效的风险，其中因抗-HPA引起PTR的比例很小，对反复多次发生PTR患者即使考虑与HPA基因多态性有关，需作HPA配型时，多数人只需检测供者与受者HPA-2、3、15基因就可有效减少血小板输注无效的发生。这样既缩短试验时间，降低试验成本、又保证患者能够及时、有效地接受输注血小板治疗。

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Correlation between polymorphism of HPA-1～6,15 and the effect of platelet transfusion in patients with acute leukemia.

MIAO Jing,ZENG Xiao-jing.Department of Hematology,the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004,Guizhou,CHINA

ObjectiveTo study the correlation between polymorphism of Human platelet antigens(HPA) and the effect of platelet transfusion,through testing the gene of the HPA-1～6,15.Methods(1)The peripheral blood simples of 30 patients with acute leukemia who had accepted platelet transfusion for two or more times were collected. The effect of platelet transfusion was evaluated by percentage platelet recovery(PPR).(2)The method of phonelic/ chloroform was applied to extract DNA.(3)PCR with sequence specific primers(PCR-SSP)was used to type HPA1～6,15 under the same conditions.The curative effect of platelet transfusion was observed.Results(1)The system alleles of HPA-1～3,HPA-5～6,HPA-15 showed polymorphism distribution;HPA-1,5,6 mainly showed aa homozygous genotype,HPA-4 presented homozygous single-state distribution,only HPA-3,15 presented bb homozygous genotype;HPA-2 had the highest heterozygous level(0.65),followed by HPA-15(0.349),HPA-3(0.3).(2)Platelet transfusion refractoriness(PTR)was found in 21 of the 30 patients of acute leukemia,with the rate of inefficiency of 70%, mainly concentrated in the patients undergoing 3 or more times of platelet transfusion.Conclusion(1)A few case of PTR is caused by anti-HPA,and testing HPA-2,3,15 genes maybe enough to improve the effect of platelet transfusion for patients of HPA matching.(2)Patients individualization should be taken into consideration in clinical practice, in order to reduce the chance of repeated transfusion and increase the effective rate.

Platelet transfusion;Effect;Acute leukemia;Human platelet antigens(HPA);Polymorhism

R733.71

A

1003—6350（2014）03—0313—05

2013-05-07)

曾小菁。E-mail：gymj0218@163.com