旱稻孢囊线虫的快速分子检测

王水南，彭德良，黄文坤，丁中*

(1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2.植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南 长沙410128；3.中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193；4.植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193)

旱稻孢囊线虫的快速分子检测

王水南1,2，彭德良3,4，黄文坤3,4，丁中1,2*

(1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2.植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南 长沙410128；3.中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193；4.植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193)

根据旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista)和常见孢囊线虫的ITS序列比对分析，设计1对旱稻孢囊线虫特异性引物He–F/He–R，特异性片段长度为281 bp。运用该特异性引物及建立的DNA提取方法和PCR体系，可特异性检测旱稻孢囊线虫单条2龄幼虫，可以从混合有1条旱稻孢囊线虫的 0.1 g水稻根组织中特异性检测出目的DNA片段。特异性引物He–F/He–R与通用引物D2A/D3B结合，运用一步双重PCR检测方法可快速鉴定单孢囊，也可从初始分离的田间土壤总线虫样品中直接检测出旱稻孢囊线虫。

旱稻孢囊线虫；PCR检测；特异性引物

旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista)是一种主要侵染水稻的植物寄生线虫，最早于日本枥木县的稻田中被发现[1]。目前该线虫病害在湖南省多个县(市)丘陵地带的水稻田发生较为普遍[2]。旱稻孢囊线虫一般寄生在寄主根部，其危害症状与水肥失调引起的症状极其相似，除吸收寄主的营养和对植物根部造成伤害外，还降低水稻对水的利用效率，继而影响寄主的生长和发育[3–4]，造成水稻减产 7%～19%[5]。建立简单快速检测旱稻孢囊线虫的方法有助于旱稻孢囊线虫的监测与防控。

早期对线虫主要依靠形态鉴定，需要大量线虫样品[6–7]，耗时费力，并可能出现误诊。简单、准确、灵敏、对样品需求量少的分子生物学检测方法已成为当前研究的热点。

在植物寄生线虫分子检测中，基于线虫种间序列差异设计特异性引物，利用PCR及其衍生技术进行快速检测是鉴定线虫种类的重要方法[8]。Buimam 等[9]利用2对特异性引物及1对通用引物建立了快速检测马铃薯白线虫(Globodera pallida)和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)的方法；王琼等[10]也设计出1对特异性引物，能快速检测出香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)。

ITS序列在线虫分子诊断中有重要意义，分析线虫的ITS区域可以快速有效地鉴定农业重要线虫种及线虫近缘种[11–13]。孢囊线虫属(Heterodera) ITS片段长度基本相同，一般通过一种酶或几种酶酶切就可以将它们区分开[14]。但是酶切方法比较耗时，并且工作量较大，利用特异性引物PCR检测方法不仅操作简单，耗时较短，而且结果准确度高。利用这一技术已成功建立起快速检测甜菜孢囊线虫(H. schachtii)[15–16]、大豆孢囊线虫(H. glycines)[17–18]、禾谷孢囊线虫(H. avenae)[19]的方法。

笔者将旱稻孢囊线虫和常见孢囊线虫的ITS序列进行比对分析，设计1对旱稻孢囊线虫的特异性引物He–F/He–R，通过PCR扩增，快速检测旱稻孢囊线虫。该方法不仅灵敏度高，特异性强，同时结合通用引物D2A/D3B，进行双重PCR扩增，可快速鉴定或检测出单孢囊、单条2龄幼虫、田间土壤总线虫及水稻根组织中的线虫，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

4个旱稻孢囊线虫样品材料(HE–1、HE–2、HE–3和HE–4)分别采集于湖南省长沙县、桃江县、衡东县和永州市；豌豆孢囊线虫(H.goettingiana)样品采集于湖南省华容县；禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫(H. Filipjevi)及大豆孢囊线虫由中国农业科学院植物保护研究所彭德良研究员惠赠。线虫感染水稻根组织采集于长沙县干杉镇。

植物基因组DNA抽提试剂盒购自天根公司，Marker DL2000、6×Loading Buffer、PCR扩增试剂盒等购自TaKaRa公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取

1) 孢囊DNA的提取。挑取饱满的孢囊放入灭菌的PCR管中，加入10 μL ddH2O，7 μL 10×PCR Buffer和3 μL 蛋白酶K溶液(600 μg/mL)，液氮中反复冻融3次，并用灭菌的玻棒研磨。冻结后，将PCR管置于–20 ℃冰箱中冷冻至少2 h。将冷冻后的PCR管置于65 ℃温育90 min，95 ℃加热10 min使蛋白酶K变性，12 000 r/min离心1 min后取上清，–20 ℃保存备用。

2) 2龄幼虫DNA的提取。旱稻孢囊线虫2龄幼虫采用水稻土壤浸液孵化[20]获得。挑取分离获得的2龄幼虫线虫，ddH2O清洗3次，吸取10 μL含单条至15条线虫的ddH2O于灭菌的PCR管中，加入5 μL ddH2O、2 μL 10×PCR Buffer和3 μL 蛋白酶K溶液(600 μg/mL)，液氮中反复冻融5次。其他操作同1)。

3) 田间多种线虫混合样品DNA的提取。采集水稻根际土壤500 mL，采用浅盘法在30 ℃恒温箱中分离土壤样品中的线虫。从分离获得的线虫样品中随机挑取若干条，ddH2O清洗3次，吸取20～30 μL线虫悬浮液于PCR管中，加入10 μL ddH2O、4 μL 10×PCR Buffer、6 μL 蛋白酶K溶液(600 μg/mL)，液氮中冷冻后充分研磨至冰融化，反复5次。其他操作同1)。

4) 线虫与水稻根组织混合样品及线虫侵染的水稻根组织DNA的提取。采用植物基因组DNA提取试剂盒提取。

1.2.2 特异性引物的设计与检测

从NCBI基因库中下载旱稻孢囊线虫及常见孢囊线虫的ITS序列，用DNAman软件进行比对和分析，设计 1对旱稻孢囊线虫特异性引物：He–F (5′–ATTCACCACCTACCCTCGCTGCCTA–3′)，He–R(5′–TTGGAGCAGCAAACCGACCAGCGAT–3′)。引入内标引物：D2A(5′–ACAAGTACCGTGAGGGA AAGTTG–3′)，D3B(5′–TCGGAAGGAACCAGCTA CTA–3′)，可扩增出所有植物线虫的D2D3片段，能直观反映DNA提取质量，有效消除假阴性。

分别提取15、10、5、1条旱稻孢囊线虫2龄幼虫的DNA，再以2倍浓度梯度将单条旱稻孢囊线虫2龄幼虫DNA分别稀释成原DNA浓度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1 /64、1 /128、1 /256。用特异性引物 He–F/He–R扩增不同数量旱稻孢囊线虫及稀释后的DNA 模板，以检验引物He–F/He–R的灵敏度。PCR反应体系为：10×PCR Buffer(Mg2+Plus) 5 μL，dNTP Mixtue 4 μL，引物He–F/He–R(10 μmol/L) 2 μL，Taq DNA聚合酶( 5 U/μL)0.4 μL，DNA模板2 μL，灭菌ddH2O补足至50 μL。采用无DNA模板为阴性对照。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。PCR扩增结束后，取5 μL PCR产物，加1 μL 6×Loading Buffer 在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，采用1×TAE 作为电泳缓冲液，120 V下电泳40 min，EB染色后用凝胶成像仪照相观测。

1.2.3 特异性引物的扩增检测

取未感染线虫的水稻根组织0.1 g至2 mL离心管中，分别加入10、5、3、2和1条旱稻孢囊线虫2龄幼虫。液氮中充分研磨后，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取水稻根组织和旱稻孢囊线虫混合样品中的DNA，以水稻根DNA模板为对照，用特异引物He–F/He–R进行PCR扩增。

分别从湖南省长沙县干杉镇旱稻孢囊线虫危害的3个水稻田块以及无旱稻孢囊线虫危害的3个水稻田块采集水稻根组织，剪取500 mg至灭菌的2 mL离心管，液氮中充分研磨后，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取 DNA，用特异性引物He–F/He–R进行PCR扩增。

1.2.4 特异性引物与通用引物结合的一步双重PCR扩增

分别提取旱稻孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、燕麦孢囊线虫、豌豆孢囊线虫及大豆孢囊线虫孢囊的DNA，进行特异性引物 He–F/He–R与通用引物D2A/D3B结合的一步双重PCR扩增，以检测引物He–F/He–R的特异性。PCR反应体系为：10×PCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，dNTP Mixtue 4 μL，引物He–F/ He–R、D2A/D3B( 10 μmol/L)各2 μL，Taq DNA聚合酶( 5 U/μL) 0.4 μL，DNA模板2 μL，灭菌ddH2O补足至50 μL。采用无DNA模板为阴性对照。PCR反应条件(退火温度改为56 ℃)及电泳、凝胶成像观测等同上。

将6个无旱稻孢囊线虫发生的水稻土样中分离的线虫混合样品分成2份，1份加入3条旱稻孢囊线虫，并从旱稻孢囊线虫危害的地块采集并分离得到4个线虫混合样品，提取所有样品的DNA，进行特异性引物He–F/He–R与通用引物D2A/D3B结合的一步双重PCR扩增，以检测引物He–F/He–R的特异性。

2 结果与分析

2.1 特异性引物的灵敏度

在特异性引物He–F/He–R扩增15、10、5、1条旱稻孢囊线虫2龄幼虫DNA样本及8个稀释后的DNA样本(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1 /64、1 /128、1 /256)中，15、10、5、1条旱稻孢囊线虫DNA扩增出的281 bp特异性条带明亮清晰，单条旱稻孢囊线虫DNA量的1/32时扩增出281 bp特异性条带也比较清晰，单头旱稻孢囊线虫2龄幼虫DNA量的1/256时也能检测到特异性条带，阴性对照中没有条带(图1)。说明特异性引物He–F/He–R检测旱稻孢囊线虫的灵敏度高。

图1 特异性引物灵敏度检测结果Fig. 1 Sensitivity of the specific primers

2.2 特异性引物扩增结果

在 0.1 g水稻根组织中，分别加入10、5、3、2和1条旱稻孢囊线虫，采用特异引物He–F/He–R对水稻根组织和线虫的混合DNA模板进行扩增，均得到1条281 bp的特异性条带，而从水稻根DNA模板中未扩增出该条带(图2)。

图 2 旱稻孢囊线虫与水稻根组织混合样品特异性引物的扩增结果Fig.2 PCR amplification results for mixtures containing H. elachista and rice root tissues using specific primers

进一步对旱稻孢囊线虫侵染的水稻根组织DNA模板进行扩增(图3)，同样也能扩增出281 bp的特异性条带，而无旱稻孢囊线虫侵染的水稻根组织DNA没有扩增出该条带。表明特异性引物He–F/He–R以及 PCR 体系可以稳定地从水稻根组织中检测出旱稻孢囊线虫。

图3 田间旱稻孢囊线虫侵染的水稻根检测Fig.3 PCR detection of rice root tissues infected by H. elachista in field

2.3 一步双重PCR扩增结果

在旱稻孢囊线虫的一步双重特异性检测中，从4个县(市)采集的旱稻孢囊均扩增出 2条稳定的条带，其中281 bp条带是由旱稻孢囊线虫的特异性引物He–F/He–R扩增产生，780 bp左右的条带是由通用引物D2A/D3B扩增产生，而菲利普孢囊线虫、燕麦孢囊线虫、豌豆孢囊线虫及大豆孢囊线虫均只有引物D2A/D3B扩增产生的780 bp左右的条带，阴性对照中没有任何条带(图 4)。说明引物 He–F/ He–R能特异性检测旱稻孢囊线虫。

图 4 旱稻孢囊线虫及其他常见孢囊线虫 DNA双重PCR扩增结果Fig.4 Duplex PCR amplification of DNA from H. elachista and other species of cyst nematode

对田间土壤总线虫样品进行检测，6个无旱稻孢囊线虫的线虫样品只有引物D2A/D3B扩增产生的780 bp左右的条带，加入旱稻孢囊线虫后能扩增出2条稳定的条带，同时采集的旱稻孢囊线虫危害的水稻田土壤总线虫样品也能扩增出2条稳定的条带，阴性对照中没有任何条带(图5)。说明引物He–F/ He–R特异性高，能用于旱稻孢囊线虫的快速检测。

图5 多种线虫混合DNA双重PCR扩增结果Fig.5 Duplex PCR amplification from mixed DNA of various nematode samples

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责任编辑：罗慧敏

英文编辑：罗 维

Rapid molecular diagnosis of rice cyst nematode (Heterodera elachista)

WANG Shui-nan1,2，PENG De-liang3,4，HUANG Wen-kun3,4，DING Zhong1,2*
(1.College of Plant Protection , Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Disease and Insect Pests, Changsha 410128, China; 3.Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 4. The State Key Laboratory for Biology of Disease and Insect Pests, Beijing 100193, China)

Based on known ITS sequences of the rice cyst Nematode (Heterodera elachista) and common cyst nematodes, one species-specific primer pair named He−F and He−R was designed for H. Elachista, the expected fragment length of the PCR products using the primers was 281 bp. Using the established DNA extraction method and PCR system with the specific primers, target fragment detected from a single second instar larvae of nematode or an individual H. elachista mixed in 0.1 g rice root tissues. Combined the species-specific primers He-F and He-R with universal primer pairs D2A and D3B, a duplex PCR was established, which detects H. elachista from cyst nematode samples primarily separated from field soil.

Heterodera elachista; PCR detection; specific primers

S432.4+5

A

1007−1032(2014)02−0178−05

10.13331/j.cnki.jhau.2014.02.014

投稿网址：http://www.hunau.net/qks

2013–11–18

国家公益性行业(农业)科研专项(200903040)

王水南(1990—)，女，湖南娄底人，硕士研究生，主要从事植物线虫学研究，shuinan1228@163.com；*通信作者，dingzx88 @aliyun.com