低温胁迫对木薯叶片叶绿素荧光参数及PSⅡ相关蛋白表达水平的影响

安飞飞，李庚虎，陈霆，李开绵*

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737；2.农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室，海南 儋州 571737)

低温胁迫对木薯叶片叶绿素荧光参数及PSⅡ相关蛋白表达水平的影响

安飞飞1,2，李庚虎1,2，陈霆1,2，李开绵1,2*

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737；2.农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室，海南 儋州 571737)

以木薯栽培种华南8号(cv. SC8)盆栽苗为材料，研究5 ℃低温胁迫7 d期间叶片叶绿素含量及荧光参数、光系统 (ⅡPSⅡ)相关蛋白表达水平的动态变化。结果表明：随着胁迫时间的延长，叶绿素a和叶绿素b含量均先下降后缓慢升高，且均在处理2 d后达到最低；低温胁迫期间，最大光合效率(Fv/Fm)、光化学量子效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(qP)、非光化学淬灭系数(NPQ)及光合电子传递速率(ETR)均显著下降，其中Fv/Fm持续下降，ΦPSⅡ、qP和ETR在胁迫2 d后达到最低后缓慢上升，NPQ在胁迫5 d后达到最低；叶绿素含量、叶绿素荧光参数显著下降表明，胁迫后 PSⅡ反应中心捕光能力、开放程度及光化学转化效率显著下降，从而抑制了叶片的光合速率；PSⅡ中D1、D2、放氧复合体(OEC)及核酮糖–1,5–二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的表达水平均在低温胁迫2 d后达到最低水平，且D1蛋白下调显著；PSⅡ中相关蛋白表达水平下调，也在蛋白质水平上验证了低温胁迫抑制叶片的光合速率。

木薯；低温胁迫；叶绿素荧光；蛋白质

木薯(Manihot esculenta Crantz)为大戟科(Euphorbiaceae)作物，原产于南美热带地区，具有高生物量、高淀粉、抗旱、耐贫瘠等诸多优良特性[1]。目前，木薯主要种植于南北纬30°间，海拔2 km以下，年均气温≥18 ℃、无霜期在8个月以上的地区[2]。木薯最适生长温度为25～29 ℃。当温度为14 ℃时生长会受到抑制，10 ℃以下时停止生长，并受寒害[3]。木薯受到低温胁迫后，叶片脯氨酸含量增幅提高，叶绿素含量下降变慢[4]，可溶性淀粉、丙二醛及保护酶活性[5]也受影响。在低温胁迫后的恢复过程中，木薯的脯氨酸、叶绿素含量增加较快[4]。木薯耐寒性与细胞膜透性、SOD和POD活性、MDA、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量息息相关[6]。

到目前为止，木薯应对低温胁迫的耐寒机理尚未清楚，低温胁迫对木薯叶片光合效率及相关蛋白质表达水平的影响少见报道。本研究以国内推广较多的高产、高淀粉栽培种华南8号(cv. SC8)盆栽苗为材料，进行5 ℃低温处理，测定低温处理7 d内叶绿素含量及叶绿素荧光参数的变化，并利用Western Blot技术检验D1、D2、OEC及Rubisco的表达水平，旨在为揭示木薯的耐寒机理和耐寒育种提供参考数据。

1 材料和方法

1.1 材 料

木薯 SC8来自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃。选取生长40 d左右、长势大体一致的盆栽苗置于恒温恒湿箱内，在(25±1) ℃、3 000 lx，16 h/8 h(光/暗)光照周期条件下培养 1 d。培养箱内温度基本稳定后，收集叶片作为未处理样品，后将培养箱温度设置为每分钟下降0.03 ℃直至5 ℃，其他条件不变。待温度刚刚降到5 ℃时，收集叶片(设为0天)，之后每隔1 d收集叶片用于检测。

1.2 方 法

1.2.1 叶绿素含量的测定

参照文献[7]提取叶绿素。称取0.1 g木薯叶片，剪碎，加入10 mL 95%的乙醇，避光浸泡提取至叶片无绿色。吸取叶绿素提取液，以95%的乙醇为对照，分别在波长663 nm和645 nm处测定吸光度。按下面的公式分别计算叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量。

式中：V为提取液用量(mL)；W为样品质量(g)。

1.2.2 叶绿素荧光参数的测定

于2013年5月20日至28日定时(10:00)将木薯植株暗适应约20 min，进行周期性饱和脉冲(6 000 μmol·m–2·s–1，脉冲时间0.8 s)后，用便携式调制叶绿素荧光仪 PAM–2500(WALZ，German)直接放在植株叶片上测定Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP、NPQ及ETR。

1.2.3 PSⅡ相关蛋白表达的分析

参照Carvalho等[8]的方法，取0.5 g木薯叶片，经丙酮沉淀后得到蛋白质。用Western Blot分析D1、D2、OEC及Rubisco的表达水平。

1.2.4 数据分析

采用Excel 2003和DPS v7.55统计软件对数据进行分析，差异显著性标准采用新复极差法(Duncan)。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对木薯叶片叶绿素含量的影响

由图1可以看出，在低温处理过程中，随着时间的延长，SC8叶片叶绿素a和叶绿素b含量均呈先下降、后缓慢升高、最终恢复低温处理前的水平的规律。低温处理前期，叶绿素a和叶绿素b含量呈下降趋势，且叶绿素a下降速度较快。由此可见，低温处理对叶绿素的影响主要表现为对叶绿素a的影响。在低温处理1 d后，叶绿素a和叶绿素b含量分别为1.80和0.55 mg/g，显著低于处理前的1.99 和0.61 mg/g，且差异达到极显著水平(P＜0.01)；低温处理2 d后，叶绿素a含量和叶绿素b含量均达到最低值，分别为1.66和0.46 mg/g；之后随着时间的延长，叶绿素a和叶绿素b含量缓慢上升，但在低温处理5 d后又出现下降；低温处理7 d后，叶绿素a和叶绿素b含量基本恢复到处理前的水平，分别为1.97和0.64 mg/g。

2.2 低温胁迫对木薯叶绿素荧光参数的影响

由表1可知，低温胁迫后不同时间点收集的叶片的Fv/Fm有显著性差异，且随着胁迫时间的延长，其值也持续下降，在处理7 d后达到最低值0.273。表明低温胁迫显著降低了木薯叶片 PSⅡ的潜在光合效率。低温胁迫2 d内，ΦPSⅡ显著下降，在2 d后达到最低值0.004，表明此时PSⅡ反应中心的光能捕获效率最低。低温胁迫后qP及ETR均表现出和ΦPSⅡ相同的变化规律，低温胁迫2 d后，qP为0.023，ETR为7.67，显著低于处理前的水平，表明此时 PSⅡ反应中心的开放程度最低，光合电子传递速率均达到最低。随着低温胁迫时间的延长，NPQ显著下降，在5 d后达到最低值，后缓慢上升，表明低温胁迫后，木薯耗散过剩光能能力下降，光保护能力降低，胁迫5 d达到最低值后，光保护能力缓慢得到恢复。

表1 低温胁迫下木薯叶片的叶绿素荧光动力学参数Table 1 Chlorophyll fluorescence kinetic parameters of cassava leaves under low temperature

2.3 低温胁迫对PSⅡ相关蛋白表达水平的影响

图2 D1、D2、OEC及Rubisco蛋白的Western Blot分析结果Fig. 2 Western Blot analysis of proteins D1, D2, OEC and Rubisco

利用Western Blot技术对低温胁迫7 d内D1、D2、OEC及Rubisco表达水平进行分析，结果见图2。低温胁迫后，D1蛋白的表达水平显著下调，且在胁迫2 d后基本不表达，表明此时D1蛋白降解速率远大于合成速率，后随着胁迫时间的延长缓慢上调，此时其合成速率大于降解速率。D2蛋白的表达水平在胁迫后下调，且胁迫2 d时达到最低，胁迫7 d后恢复到低温处理前的水平。OEC在胁迫过程中表达水平下调较缓，在胁迫2 d时达到最低，此时PSⅡ的放氧能力较低，7 d后恢复到低温处理前的水平。Rubisco的表达水平在低温胁迫前期下调明显，胁迫2 d时最低，后缓慢上升，5 d时又下降，之后上升。这些蛋白表达水平的变化与叶绿素荧光参数ΦPSⅡ的变化相一致，在蛋白质水平上验证了低温胁迫抑制叶片的光合作用。

3 结论与讨论

叶片中的色素含量是反映植物光合能力的一个重要指标，叶绿素在光能吸收和转换中起着非常重要的作用[9]。低温常常引起叶绿素含量变化。白青华等[10]发现，低温胁迫后辣椒幼苗叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均下降。温度越低，叶绿素a及总叶绿素含量下降幅度越大[11–12]。Liu等[13]研究发现，随着低温处理时间的延长，患白化病小麦的叶绿素含量逐渐降低。高丽慧等[14]、Zhou等[15]也有类似的研究结论。本试验中，低温胁迫初期的木薯叶片叶绿素 a、b含量均呈现下降趋势，后随着时间延长缓慢上升。低温引起木薯叶片叶绿素含量下降的原因可能是低温胁迫导致光系统发生不可逆的变化，进而影响到叶绿素含量[16]。此外，低温会导致叶绿素合成障碍[17]，从而使得叶绿素含量急剧下降。

植物叶片中叶绿素荧光与光合作用中光系统对光能的吸收、传递、耗散和分配等反应紧密相连，各种因素对光合作用的影响都可通过叶绿素荧光参数的变化反映出来[18]。许多胁迫因子，如干旱、热害和冷害等都可以使PSⅡ光能利用效率下降。本研究中，低温胁迫后Fv/Fm显著下降，表明PSⅡ已经受到低温胁迫的损害，这与周建[19]、吴雪霞[20]、刘慧英[21]等的研究结果一致，其值的下降可能是低温胁迫导致 PSⅡ反应中心失活引起。在逆境胁迫下，PSⅡ反应中心失活将严重影响光化学反应[21]。本试验中，随着温度的降低，ΦPSⅡ、qP、NPQ和ETR均显著下降，表明PSⅡ反应中心失活使得天线色素原初捕光能力减弱，吸收光能减少，光合电子传递能力减弱，因此，低温胁迫降低了PSⅡ的光能捕获能力与光合电子传输能力，进而降低了木薯叶片光合效率。低温导致光合速率下降在马铃薯中也有类似的结果[22]。

D1、D2蛋白是组成PSⅡ的重要组分[23]，温度会诱导其构象发生变化，从而抑制 PSⅡ的电子传递。D1对温度特别敏感，正常条件下，D1的合成和降解处于动态平衡，一旦受到胁迫，D1的降解速率会超过合成速率，导致PSⅡ反应中心遭受破坏[24]。本试验中，D1在胁迫后表达水平急剧下降，此时D1蛋白大量降解，这可能与胁迫环境中产生的大量活性氧有关[25]。低温胁迫常常使相对分子质量为33 000的外来蛋白从PSⅡ复合体中释放或松散地与PSⅡ结合，使光合放氧过程不稳定[26]，进而使OEC的表达水平下调。本试验的结果也表明，在低温胁迫后OEC的表达水平下调。Rubisco活性与光合速率有很好的相关性[27]。本研究中，低温胁迫降低了木薯叶片Rubisco活性，这可能是导致叶片光合速率下降的主要原因。

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责任编辑：罗 维

英文编辑：罗 维

Influence of low temperature stress on chlorophyll fluorescence parameters and expression levels of proteins in PS ofⅡ cassava

AN Fei-fei1,2, LI Geng-hu1,2, CHEN Ting1,2, LI Kai-mian1,2*
(1.Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China; 2.Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Germplasm Resources Conservation and Utilization of Cassava, Danzhou, Hainan 571737, China)

Potting seedling of cassava cultivar SC8 was used as materials to investigate the changes of leave chlorophyll content, chlorophyll fluorescence parameters and the expressions of proteins in PSⅡof cassava seedlings exposed to low temperature (5 ℃) for 7 days. The results show that during the stress, chlorophyll a and chlorophyll b contents were both decreased first and then slowly increased, reaching the minimum 2 days after stress; maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), photochemical quantum efficiency of photosystemⅡ(ΦPSII), photochemical quenching (qP), non-photochemical quenching (NPQ) and electron transport rate (ETR ) were significantly decreased with Fv/Fmcontinuously declined, while ΦPSII, qPand ETR first decreased to minimum level 2 days after stress, and then slowly rose, and NPQ decreased to minimum level 5 days after stress. The significant decrease of chlorophyll content and chlorophyll fluorescence parameters indicate that the light-harvesting ability, openness and photochemical conversion rate in PSII reaction center were decreased significantly, which inhibiting the photosynthetic efficiency of cassava leaves. The expression level of D1, D2, OEC and Rubisco reached the lowest 2 days after stress with D1 decreased significantly. The down-regulation of theexpression of proteins in PSⅡverifies at protein level that low temperature inhibits photosynthesis of leaves.

cassava; low temperature stress; chlorophyll fluorescence; proteins

S533.01

A

1007−1032(2014)02−0148−05

10.13331/j.cnki.jhau.2014.02.008

投稿网址：http://www.hunau.net/qks

2013–08–15

国家“973”计划项目(2010CB126606)；国家自然科学基金国际合作NSFC–CG项目(31361140366)；“十二·五”农村领域国家科技计划课题(2012AA101204–2)；中央级公益性科研院所基本科研业务专项(PZS–062)

安飞飞(1985—)，女，河北保定人，硕士，主要从事木薯蛋白质组学研究，aff85110@163.com；*通信作者，likaimian@sohu.com