冰糖橙×枸橼杂交后代的胚抢救及杂种鉴定

张新宇，陈驰杰，张文，田洋，陈严，王吾谦，邓子牛,2，李大志,2*

(1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家柑橘改良中心长沙分中心，湖南 长沙 410128；3.湖南省园艺研究所，湖南 长沙 410125)

冰糖橙×枸橼杂交后代的胚抢救及杂种鉴定

张新宇1，陈驰杰1，张文3，田洋1，陈严1，王吾谦1，邓子牛1,2，李大志1,2*

(1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家柑橘改良中心长沙分中心，湖南 长沙 410128；3.湖南省园艺研究所，湖南 长沙 410125)

为获得冰糖橙×枸橼的合子苗，以抗柑橘溃疡病枸橼为父本，以高感病品种冰糖橙为母本进行杂交，利用胚抢救技术获得杂交后代，然后利用筛选出的SSR引物对亲本和子代的基因组DNA进行PCR扩增，分析并鉴定杂交后代中的合子苗。结果表明：在最终获得的359株杂交后代中，利用SSR标记能鉴定出合子苗12株。

冰糖橙；枸橼；杂种鉴定；胚抢救技术

冰糖橙(Citrus sinensis Osbeck ‘Cheng’)为湖南省主栽的甜橙品种之一，是高度感柑橘溃疡病的品种[1–2]。柑橘溃疡病严重影响柑橘产业的发展[3]。农业生产中运用农业防治、化学防治和生物防治等技术来防治柑橘溃疡病，但均不能彻底根治[4–7]。Deng等[8]对湖南柑橘资源接种离体和活体溃疡病菌，获得了1个主动抗溃疡病资源——枸橼。近年来，胚抢救技术在柑橘育种中的应用越来越广泛。该技术有效地克服了柑橘的多胚性障碍[9]，加快了育种进程。简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)已被广泛用于对柑橘合子苗的早期鉴定[10–11]。本试验中将冰糖橙与枸橼进行杂交，通过胚抢救技术获得杂交后代，再利用SSR分子标记对杂交后代进行早期鉴定，旨在为柑橘杂交育种提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

母本冰糖橙来自湖南省怀化洪江市安江镇，父本枸橼(Cirtrus medica L.)来自湖南农业大学国家柑橘改良中心长沙分中心。

在枸橼开花前采集花粉，干燥保存。在冰糖橙花药成熟，但花朵未开放时，对母本去雄，并授以父本枸橼的花粉，然后套袋防止污染。

1.2 方 法

1.2.1 利用胚抢救技术获得杂交后代

授粉后约 90 d采收果实。在超净工作台上用75%的乙醇将果实表面消毒，然后在酒精灯上灼烧，直至果实颜色变黑。用手术刀沿果实赤道面划开一道口子(勿碰伤种子)。取出种子，剥开种皮，将胚分离，置于MT+1 mg/L GA3+10%蔗糖的固体培养基中。待胚成熟后，将胚移入MT+1 mg/L GA3+3%蔗糖的固体培养基中。

1.2.2 杂交后代的移栽

将发酵好的营养土进行高温、高压灭菌。在超净工作台上移栽培养皿中的幼苗。用无菌水洗净幼苗根部残留的培养基，将幼苗栽入装有营养土的小塑料盆中。将移栽后的幼苗置于26℃、相对湿度80%的组培室生长，待幼苗长出新的叶片后进行炼苗。炼苗成功后，将幼苗移栽到大塑料盆中，置于塑料大棚中生长。

1.2.3 亲本和子代基因组DNA的提取及浓度检测

参照改良的CTAB法，提取亲本叶片和子代幼苗叶片的基因组DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测亲本和子代的基因组DNA浓度和纯度。

1.2.4 亲本和子代基因组DNA的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测

PCR反应体系20 μL，其中10×PCR Buffer 2 µL，MgCl2(20 mmol/L)2 µL，dNTPs(10 mmol/L)0.3 µL，上游引物(2.5 μmol/L)2 µL，下游引物(2.5 μmol/L)2 µL，Taq聚合酶(2 U/µL)0.5 µL，DNA模板1.5 µL，无菌ddH2O 9.7 µL。

PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，Tm复性1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物置于4 ℃冰箱保存。

采用3.0%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，电压120 V，时间30 min，利用凝胶成像系统进行拍照和观测。

1.2.5 SSR标记引物的筛选

从32对引物(表1)中筛选出能在亲本间产生特异性位点的引物，然后利用得到的特异性引物对杂交后代的基因组DNA进行扩增分析。

表1 32对引物组合Table 1 32 primer combinations

1.2.6 杂交后代的鉴定

参照文献[12]，用筛选出的多态性高、能在亲本间产生特异性位点的引物对杂交后代进行鉴定：杂交后代SSR带谱中的条带均来自父本和母本，没有杂带出现，并具有父本的特异性条带时，判断这个杂交后代为真杂种。

2 结果与分析

2.1 冰糖橙与枸橼的杂交授粉和胚抢救结果

以枸橼为父本，对母本冰糖橙授粉5 000朵花，结果502个，座果率为10.04%，明显高于理论座果率，其原因可能是授粉提高了座果率，或是父、母本之间的亲和性较好。剥离其中的121个果实，得到330粒种子，获得2 217个胚，单种子平均胚数为 6.72个，可见，冰糖橙×枸橼的种子具有多胚性。2 217个胚经过胚抢救(图1)，获得547株幼苗，成苗率为24.67%。炼苗和移苗(图1)后经过4个月的生长，最终得到杂交后代 359株，成活率为65.63%。胚的死亡原因可能是操作失误，或是培养过程中长霉导致，也可能是胚较弱小，不易成苗。

图1 冰糖橙×枸橼的果实、分离及培养过程中的杂种胚、移栽的幼苗Fig. 1 Fruits, hybrid embryos in the process of isolation and culture and transplanted seedlings of sweet orange and citron

2.2 冰糖橙与枸橼杂交后代的形态学观察

珠心苗与合子苗的主要差异是新梢颜色。父本枸橼的新梢颜色为紫红色，冰糖橙则为嫩绿色，6株杂交后代出现了深浅不同的紫红色，可初步认定这6株杂交后代为合子苗(图2)。

图2 父、母本及杂交后代的新梢Fig. 2 New shoots of parents and hybrid offspring

2.3 DNA的提取和特异引物的筛选结果

提取的各材料基因组DNA条带大小一致，没有蛋白质和RNA污染(图3)，可用于后续试验。利用 32对引物对冰糖橙和枸橼的基因组 DNA进行PCR扩增，从中筛选出 CAT01、AG14、GA18、CAC33、CTT01、CAGG9和TAA27等共7对重复性好、多态性高的引物(图4)。

图3 DNA检测结果Fig. 3 DNA detection

图4 亲本对SSR引物的筛选结果Fig. 4 Screened results of parents to SSR primers

2.4 杂交后代的鉴定结果

在用引物GA–18对枸橼杂种后代进行鉴定时，子代4、5、6、12、18、19、22出现了父本的特异性条带(图5)；用引物CAT–01、AG–14进行鉴定时，子代4、5、6、12、18、19、22同样出现了父本的特异性条带(图6、7)，由此可确定子代4、5、6、12、18、19、22为合子苗。最终从359株杂交后代中鉴定出合子苗12株。在形态学上发生颜色变化的6株杂交后代，经分子标记鉴定皆为合子苗。此外，还鉴定出6株未发生形态学变化的杂交后代为合子苗。

图5 引物GA–18对杂交后代的SSR检测结果Fig. 5 Test results of SSR fingerprint amplified with primer GA–18 in hybrids

图6 引物CAT–01对杂交后代的SSR检测结果Fig. 6 Test results of SSR fingerprint amplified with primer CAT–01 in hybrids

图7 引物AG–14对杂交后代的SSR检测结果Fig.7 Test results of SSR fingerprint amplified with primer AG–14 in hybrids

3 结论与讨论

a.有性杂交和胚抢救。湖南的柑橘种质资源丰富，地方性良种多，为柑橘的杂交育种提供了便利条件。由于冰糖橙具有多胚性，多数无性胚在生长过程中竞争有性胚的营养，造成有性胚的生长较弱或死亡。本试验中利用胚抢救技术获得了359株杂交后代，可见，胚抢救技术能提高柑橘育种效率，加快杂交育种进程。

b.冰糖橙×枸橼杂交后代的 SSR鉴定。目前，SSR分子标记已广泛应用于遗传图谱的构建、遗传多样性分析和杂种鉴定。韩国辉等[13]利用SSR分子标记鉴定了柑橘2个不同杂交组合的子代，鉴定率分别达99.04%和100%。刘梦培等[14]利用6对SSR引物对华仁杏的杂交后代进行了鉴定，鉴定率达91.25%，说明利用SSR分子标记进行杂种的早期鉴定是切实可行的。本试验中利用SSR引物GA–18、CAT–01和AG–14对359株杂交后代进行鉴定，最终鉴定出合子苗12株。

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责任编辑：王赛群

英文编辑：王 库

Embryo rescue and hybrid identification of sweet orange (Bingtang) and citron

ZHANG Xin-yu1, CHEN Chi-jie1, ZHANG Wen3, TIAN Yang1, CHEN Yan1, WANG Wu-qian1, DENG Zi-niu1,2, LI Da-zhi1,2*
(1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Changsha Subcenter, National Center for Citrus Improvement, Changsha 410128, China; 3.Hunan Horticultural and Research Institute, Changsha 410125, China)

In order to obtain zygotic seedlings from hybrid of sweet orange (Bingtang) and citron, a experiment was conducted by taken Bingtang as female parent and citron with resistance to canker as male parent. Embryo rescue technology was firstly used to obtain filial generation, and then the genomic DNA of parents and their hybrids were amplified by PCR using screened simple sequence repeats (SSR) primers, and zygotic seedlings of next generation were further identified. The results showed that twelve zygotic seedlings were identified from the 359 obtained seedlings by SSR markers.

Bingtang sweet orange; citron; molecular marker; embryo rescue

S666

A

1007−1032(2014)02−0157−05

10.13331/j.cnki.jhau.2014.02.010

投稿网址：http://www.hunau.net/qks

2013–08–02

国家自然科学基金项目(31071773)；“十二·五”国家“863”计划项目(2011AA100205)；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(SCX1202)

张新宇(1972—)，男，湖南长沙人，硕士研究生，主要从事抗病分子研究，1292333949@qq.com；*通信作者，Ldazhi@163.com