脐带间充质干细胞无血清和含胎牛血清培养体系比较

陈林，张坤，董伟，杨珂，艾辉，陈禄华

(重庆市干细胞企业工程研究中心，重庆 401320)

脐带间充质干细胞无血清和含胎牛血清培养体系比较

陈林，张坤，董伟，杨珂，艾辉，陈禄华

(重庆市干细胞企业工程研究中心，重庆 401320)

为了比较在无血清与含胎牛血清培养基中人脐带间充质干细胞的增殖能力、生物学特性、分化潜能，将脐带华通氏胶剥出剪碎，分别在无血清与含胎牛血清培养基中培养扩增脐带间充质干细胞。用MTT法检测细胞增殖活性，并绘制生长曲线;在倒置显微镜下对细胞形态进行观察;利用流式细胞仪检测鉴定其表面标记CD73，CD90，CD105，CD14，CD34，CD45，CD79a及HLA－DR的表达;将成骨及成脂诱导液培养1～2周后观察其细胞形态学变化，用碱性磷酸酶染色鉴定其成骨情况，油红O染色鉴定其成脂情况。结果表明:无血清与含胎牛血清培养基所培养的人脐带间充质干细胞在细胞形态、增殖活性、表面标记和分化潜能相似;但在无血清培养基成分中无动物源蛋白引入，是更理想的人脐带间充质干细胞培养基种类。

间充质干细胞;细胞培养;无血清培养基;胎牛血清

脐带中间充质干细胞含量远高于骨髓和脐血，且具更强更稳定的增殖分化能力［1］，且脐带取材方便，来源充足，对供者无伤害，病原微生物感染率小，是一种最好的间充质干细胞来源。脐带中间充质干细胞来源于中胚层，具有自我复制、多向分化和免疫调控能力，且能定向分化为成骨细胞脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞等［2］，是各种多功能干细胞中治疗血液疾病和再生医学惟一安全的异体干细胞［3］。目前，常规的MSCs培养体系中均加入了一定比例的动物血清成分。血清是由不同分子组成的复杂混合物，给细胞培养的标准化、细胞表达产品的分离纯化带来了很大的困难，同时动物血清内的特异蛋白是已被确定的过敏原，可能对将来临床应用构成威胁［4］。无血清培养在很大程度上避免了含血清培养的缺陷。本研究通过比较无血清培养体系和含血清培养体系培养的人脐带间充质干细胞，探寻了一种无血清培养人间充质干细胞的方法，以达到临床治疗的应用标准。

1 试验材料和方法

1.1 实验材料

主要试剂:DMEM/F12培养基、TrypLE 1X、脂肪细胞和成骨细胞诱导培养基均购自Gibco公司;胎牛血清FBS购自Stemcell公司;无血清培养基购自Lonza公司;CD14－FITC，CD34－PE，CD45－FITC，CD79a－PE，HLA－DR FITC购自Beckman Coulter公司;CD73－FITC，CD90－FITC，CD105－PE购自eBioscience公司;MTT、DMSO和油红O购自Sigma公司;碱性磷酸酶试剂盒购自碧云天公司。

主要设备:二氧化碳培养箱采购自Thermo Fisher公司;Bio－Rad 680酶标仪购自Bio－Rad公司;EpicsXL ADC流式细胞仪购自Bcekman Coulter公司;IX51显微镜采购自奥林巴斯公司。

所有的脐带标本均来自足月自然分娩或剖宫产的健康产妇，并征得家属及产妇同意。脐带采集之前已对产妇进行了艾滋病病毒抗体检查、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒核心抗体、梅毒螺旋体抗体、丙型肝炎病毒抗体，全部检查结果为阴性，合格。

1.2 实验方法

1.2.1 人脐带间充质干细胞的分离、培养及扩增

在生物安全柜中取出采回的胎儿脐带，置于培养皿中。将其剪成小段，用无菌PBS充分洗涤除去残留血液，用镊子小心除去血管和外膜，分离得到纯净的华通氏胶组织，将其剪碎成1～2 mm3的小块，将0.5 g组织分别置于无血清培养基及含10%胎牛血清培养基中，并移至T75培养瓶中，置37℃、5%CO2体积浓度的饱和湿度的二氧化碳培养箱内培养。

每日定期观察，第5天和第10天全量换液，以后每3天全量换液1次。待培养瓶内细胞已生长至80%融合，用TrypLE于室温下消化并轻轻拍打，镜下观察培养瓶内细胞已完全成为悬液，终止消化过程，以1×104/cm2细胞浓度传代扩增。

1.2.2 细胞生长活性测定

称取250 mg MTT，加50 mL灭菌PBS溶液使MTT充分溶解，再用0.22μm的醋酸纤维滤器除菌，4℃避光保存备用。

取以无血清培养基培养和含血清培养基培养的状态良好的P0代细胞，分别加入无血清培养基和含血清培养基吹打混匀制成浓度为5×104/mL的细胞悬液。

取7块96孔板，在外周孔加入灭菌PBS填充，第二竖排孔加入无血清培养基作为空白对照，其余每孔接种100μL无血清培养基制成的细胞悬液，并加入200μL无血清培养基填充，每3天对96孔板内培养基进行换液。再取7块96孔板进行以上操作，但将培养基换为含血清培养基，细胞悬液换为用含血清培养基制备的细胞悬液。

将96孔板置于二氧化碳培养箱内培养。培养开始后每24 h分别取出2块96孔板，在酶标仪OD492nm处测量各孔的吸光值。

计算各孔波长吸光度值和空白96孔板吸光度值的差值即A值，以时间为横轴，A值为纵轴绘制生长曲线。

1.2.3 细胞表面标志的鉴定

分别取用含血清和不含血清培养基培养的P2代脐带间充质干细胞，用TrypLE消化后制成单细胞悬液，细胞浓度为2×106/mL。取100μL细胞悬液，分别加入抗体10μL于20℃避光孵育20 min。抗体分别为小鼠抗人CD14－FITC，CD34－PE，CD45－FITC，CD79a－PE，HLA－DR－FITC，CD73－FITC，CD90－FITC，CD105－PE。孵育结束后，洗涤细胞2遍，加入300μL流式鞘液中，待流式细胞仪检测。

1.2.4 MSCs诱导分化

1)脂肪细胞诱导分化

收集P2代对数生长期的脐带间充质干细胞，以1×104/cm2密度接种于24孔板中，待细胞达到60%融合时，去掉原培养基，PBS洗涤1次，更换为脂肪细胞诱导培养基，每3～4天换液1次，培养7～14天。观察到脂滴形成时，吸去诱导培养液，PBS洗涤2次，体积分数为4%的多聚甲醛固定15 min，以质量分数为0.5%油红O染色20 min，水洗数次，在显微镜下观察、拍照。

2)成骨细胞诱导分化

收集P2代对数生长期的脐带间充质干细胞，以1×104/cm2密度接种于24孔板中，待细胞达到60%融合时，去掉原培养基，PBS洗涤1次，更换为成骨细胞诱导培养基，每3～4天换液1次。培养14天后，吸去诱导培养液，PBS洗涤2次，无水乙醇固定10 min，水洗数次，加入碱性磷酸酶染色剂，孵育8～12 h，水洗数次，在显微镜下观察、拍照。

2 实验结果

2.1 细胞形态学观察

无血清组在培养第10天可见少量细胞迁出，细胞呈纺锤形、长梭形、多角形、逗号等形态。原代培养第12天细胞融合达到约70%(见图1)，大部分细胞呈纺锤形和长梭型，少量细胞呈多角形。传代后细胞生长速度加快、纯度提高，以平行排列生长为主或呈漩涡状生长(见图2)。约2～3天后可再传代。

图1 无血清培养原代第12天(40×)

图2 含血清培养原代第12天(40×)

血清组在培养第10天可见部分细胞迁出，细胞形态与无血清组无异，细胞生长度速度较无血清组稍快。原代培养第12天细胞融合达到约80%(见图2)，细胞形态与无血清组无异。传代后细胞生长速度和细胞纯度均有明显提高，亦呈平行排列生长或漩涡状生长(见图3)。约2～3天后可再传代。

图3 无血清培养P2代第2天(40×)

图4 含血清培养P2代第2天(40×)

2.2 细胞生长活性测定

横轴为培养时间(以每天计)，纵轴为OD值绘制生长曲线。细胞接种1～2天为缓慢生长的潜伏期，从第3天即进入对数生长期，两种培养基培养的细胞都从第5天进入平台期，细胞倍增时间为30 h，P＞0.05，两种培养基培养的细胞增殖曲线无显著差异(见图5)。

图5 两种培养基培养的细胞增殖曲线

2.3 细胞表面标志分析

流式细胞术分析表明，无血清培养基和含血清培养基培养的脐带MSCs均高表达粘附分子和基质细胞标记CD73，CD90，CD105，不表达造血细胞标记CD14，CD34，CD45，CD79a(图6)，不表达主要组织相容性复合物类分子HLA－DR。

图6 两种培养基培养的细胞表面标志比较

2.4 体外诱导分化

2.4.1 脂肪细胞诱导分化

经成脂诱导2周后，P2代人脐带MSCs可以分化为脂肪细胞。进行油红O染色，可见胞浆中有大量被染成红色的脂滴(见图7)。

2.4.2 成骨细胞诱导分化

经成骨诱导2周后，P2代人脐带MSCs可以分化为成骨细胞。进行碱性磷酸酶染色，可以看见大量紫色沉淀(见图8)。

图7 人脐带MSC油红O染色结果(400×)

图8 人脐带MSC碱性磷酸酶染色结果(40×)

3 讨论与结论

间充质干细胞具有自我更新能力和多向分化能力［5］，同时还具有双向免疫调节的功能［6］。目前分离人脐带间充质干细胞，主要来源于自脐带的wharton’s jelly及脐静脉皮下层［7－8］，其主要分离方法是酶消化法和组织块法。本实验采用组织块法由贴壁的组织直接获得MSC，相对酶消化法的化学反应过程而言对细胞伤害较小［9］。

获得安全可靠、质量稳定的间充质干细胞是临床应用的前提，常规的血清培养体系由于血清的特性，异种血清的使用存在着很多不确定因素［10］，比如，血清批次之间的差别、异种蛋白的免疫原性、潜在的病原体等。异种血清的种种潜在危害，使其生物安全性受到普遍质疑［11］。由于动物血清应用的缺陷，有些研究人员采用人血清来代替胎牛血清，促进细胞增殖并且保持间充质干细胞的分化潜能，随着细胞扩增以及干细胞临床应用量的增大，人血清来源成为难以解决的问题［12］。无血清培养避免了含血清培养带来的难题，成为当今细胞培养领域的一大趋势。

无血清培养和含血清培养都成功获得了大量脐带MSC，两种培养基所培养细胞在形态方面类似，含血清培养的细胞体积略小，增殖速度略快于无血清培养。细胞免疫表型的分析表明，两种培养基所培养细胞的免疫分子表达类似，CD73，CD90，CD105≥95%;CD14，CD34，CD45，CD79a，HLA－DR≤2%，符合ISCT组织对间充质干细胞的定义要求［13］。在诱导培养条件下，两种培养基所培养细胞均有相似的成骨和脂肪分化能力，具有较强的可塑性与多向分化潜能。

总之，本研究利用无血清培养基成功分离培养出脐带MSC，和含血清培养基培养出的细胞具有相似的生物学特性，完全可以替代含血清培养基。随着国家《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》等文件出台，对于培养基成分提出了严格要求，可以预见未来无血清培养将在临床干细胞培养领域占据主导地位，具有广阔的应用前景。

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(责任编辑 何杰玲)

Com parison of the Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Cultured by Serum-free Medium and Fetal Bovine Serum-contained Medium

CHEN Lin，ZHANG Kun，DONGWei，YANG Ke，AIHui，CHEN Lu－hua
(Chongqing Enterprise Engineering Research Center of Stem Cell，Chongqing 401320，China)

To compare the differences of proliferation，biological characteristics，differentiation potential of serum－free and fetal bovine serum－contained medium cultured human umbilical cord－derived mesenchymal stem cells.Separated Wharton’s jelly from human umbilical cord，cultured umbilical cord mesenchymal stem cells in serum－freemedium and serum－supplied medium.Detected the cells’proliferation rate by MTTmethod and get the cell growth curve;observe the cellmorphology by microscope;Use flow cytometer to identify surface markers CD73，CD90，CD105，CD14，CD34，CD45，CD79a，and HLA－DR.We observe cells change of shape after cells cultured by Osteogenesis Differentiation and Adiposeness Differentiation medium.Use alkaline phosphatase and oil red O stai－ningmethods to ensure cells’differentiation.The cell morphology，proliferation activity，surface markers and differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells cultured in serum－freemedium are similarwith which cultured in FBS－suppliedmedium.The composition of the serum－freemedium are animal origin free and the composition are known，so it’s a better human umbilical cord mesenchymal stem cell culturemediamedium

mesenchymal stem cells;cell culture;serum－freemedium;Fetal bovine serum

Q2－33

A

1674－8425(2014)09－0057－05

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.09.013

2014－03－16

陈林，男，四川德阳人，主要从事生物技术方面的研究。

陈林，张坤，董伟，等.脐带间充质干细胞无血清和含胎牛血清培养体系比较［J］.重庆理工大学学报:自然科学版，2014(9):57－61.

format:CHEN Lin，ZHANG Kun，DONGWei，et al.Comparison of the Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Cultured by Serum－free Medium and Fetal Bovine Serum－contained Medium［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(9):57－61.